高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9′107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。特点

　　1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～

　　2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于1h 。

　　4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。

　　5.适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的75% ～80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。

　　高效液相色谱仪一般分为四个部分：高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统。此外还可以根据一些特殊的要求配备一些附属装置，如梯度洗脱、自动进样及数据处理装置等，如图1所示。

　　方法原理：在相同的色谱条件下，相同物质具有相同的保留时间，据此可对某物质进行定性分析；在一定浓度范围内，待测物质含量与仪器响应值呈线性关系，通过建立标准曲线，可实现对待测物质的定量分析。

　　取苯酚标准使用液0.50、1.00、2.00 mL于10 mL的具塞离心管中，用甲醇定容至5 mL，混匀。待测。

　　测定标准系列，再测定样品。根据标准系列中苯酚的保留时间，定性确定样品中的目标物。

　　2. 标准系列和样品中苯酚的保留时间、峰面积、峰高等实验数据：表2 标准系列和样品中苯酚的谱图峰的特征数据

　　答：流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)，气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器，C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗，更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的流动相中，更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。

　　答：梯度洗脱是采用两种(或多种)不同洗脱能能力的溶剂,在分离过程中按一定程序连续改变流动相的浓度配比和极性的一种洗脱模式.当样品混合物中化合物的保留差异很大,用单一流动相等度洗脱时,分离时间太长,而且随保留值增大,后洗脱的色谱峰谱带变宽,使峰检测发生困难.有时甚至会发生部分化合物保留太强,不能洗脱下来,此时采用梯度洗脱.梯度洗脱一般用液相色脯装置来实现.高压梯度,低压梯度两种装置.

　　正相高效液相色谱法中流动相的极性小于固定相的极性，也就是以及性键合相为固定相（常以氨基、氰基键合相等作为固定相）。

　　反相高效液相色谱法中流动相的极性大于固定相的极性，也就是以非极性键合相为固定相（常以十八硅烷C18、辛烷C8、甲基C1、苯基等作为固定相）。

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