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　　1、峰形后拖解决方案和实例 继前一篇峰形前拖解决方案，我们对峰形后拖的情况及其解决方案也进行了总结。与峰形前拖解决方案相同，在这里我们也同样的撇开所有的污染、塌陷、死体积等其它因素，假设系统是好的，柱子是新的、好的，单纯探讨液相方法与峰形后拖之间的关系，通过调整液相方法来解决峰形前拖的问题。这样有利于厘清拖尾产生的根本原因，对峰形拖尾的问题提供一些经验上解决方案。首先让我们了解一下峰形后拖的几种常见形式，三种常见的拖尾如下：系统是好的，柱子是好的，为什么会产生后拖？我们还是回顾一下，色谱分离的一般过程，正常的峰形应该是样品在色谱柱上均匀前移的情况下得到的，浓度分布在整个通过色谱柱柱床的过程中任何时

　　2、候都呈正态分布，如下图所示：色谱分离是一个物理过程，样品分子经过在固定相与流动相之间的多次分配、吸附解吸，由于不同分子与固定相和流动相之间的相互作用力的差异而使它们在色谱柱中的移动速度不同，以此实现分离的目的。相同色谱条件下，有些化合物容易产生拖尾，有些则不产生拖尾，这说明拖尾的产生跟样品本身的性质是密切相关的，通常非极性和弱极性的化合物能获得良好的峰形，而带有COOH、NH2、NHR、NR2等极性基团的化合物则比较容易产生拖尾。可以想象一下，样品分子在分析过程所处的环境，一是流动相，二是固定相，流动相可以自由流动的，均一性比较好，因此可以认为样品分子四周都被相同组成的流动相所包围，其对每个样

　　3、品分子的相互作用力也是均匀的、对称的，不应该是引起浓度分布发生变化的主要原因。考虑固定相，固定相中除了C18长链外还有填料键合时残余的硅羟基，由于C18长链是非极性的，其与样品分子的相互作用力也是很微弱的范德华力，而硅羟基则具有一定的极性SiOH，在pH一定的条件下甚至还会发生电离，形成SiO 形式的离子态。SiOH和SiO对于极性化合物之间的作用力则是一种极性的静电作用力，这种作用力比范德华力要强得多，同时，因为硅胶表面键合了C18长链，由于空间位阻作用，样品分子中能接触到残余硅羟基的机会不会很多，只有少部分的分子才能与残余硅羟基产生作用。这样，大多数的样品分子如非极性分子一样均匀前移，而少

　　4、量的样品分子由于这种静电作用力的存在而被推迟洗脱出来，导致样品分子的浓度分布发生变化，产生后拖。拖尾严重的程度与样品分子极性大小和残余硅羟基的多少有着直接的关系。既然残余硅羟基对样品的次级保留效应是导致峰形后拖的主要原因，那我们先了解一下残余硅羟基是怎么回事。我们先借用一下wsy18的一个图来了解一下填料合成的整个过程：以C18的填料合成为例，C18的氯硅烷与硅胶表面的硅羟基发生反应，C18硅烷基取代硅羟基中的氢原子在硅胶的表面键合上C18长链。完全硅羟化的硅胶表面硅羟基浓度为8mol/m2，因为C18硅烷基的体积远比一个氢原子大得多，由于空间位阻的作用，通常与C18硅烷基发生反应

　　5、的仅达23.5mol/m2，也就是说只有不到50的硅羟基被反应掉，剩下的50多的硅羟基残留在硅胶表面。由于硅羟基容易对样品分子产生次级保留效应引起拖尾，因此需要将硅羟基反应或屏蔽掉，去掉这个作用位点以消除次级保留效应，通常的办法是用小分子的硅烷跟硅羟基反应，如图解中的三甲基氯硅烷，使硅羟基中的氢变成了三甲基硅烷的一个惰性基团，反应掉了很多硅羟基，同时未能反应的许多硅羟基也被屏蔽掉，有效阻止了样品与硅羟基接触的机会，避免了次级保留效应的产生。但不管怎么样三甲基硅烷还是比氢原子大得多，同样由于空间位阻的作用不能将所有的残余硅羟基反应掉，既然存在就仍然有跟样品分子接触的机会，相同的样品在

　　6、不同品牌的柱子上产生拖尾的严重性不同，主要的也就是接触硅羟基的机会大小的问题，从填料合成的角度而言就是键合方式是否紧密、封尾是否彻底，紧密的键合和彻底的封尾能显著减少这种机会，因而改善峰形。美国Welch公司Ulimate品牌的XBC18、AQC18和Xtimate C18采取的就是紧密键合和彻底的双峰尾工艺。为什么残余硅羟基会引起拖尾？我们先了解一下硅羟基的结构：Si-O-H，硅胶基质上硅的四面都是氧原子，如下图：在表面上连接有硅羟基的硅原子来说，其中一个键连接了一个羟基，其它三个键都与一个氧原子相连，由于氧的电负性比硅强，三个氧原子对硅原子产生了吸电子效应，因此对于硅上的羟基而言，这个硅原

　　7、子对羟基是一个吸电子基团，使得硅羟基具有一定的酸性，其pKa约为4.54.7。根据电离规律，流动相的pHpKa2即pH6.7时，99以上的硅羟基应该是呈离子状态的，即SiO ，而pKapH2即pH2.5时，酸性环境抑制了硅羟基的电离，99以上的硅羟基应该是呈分子状态的，即SiOH，但其极性仍然存在，即SiOH。发现峰形后拖时，本人建议试试一下几种解决方案，以消除峰形后拖的状况、改善峰形。1. 先检查一下是否是样品过载样品过载，通常会引起峰形变差，导致前拖、后拖或平头峰，如果出现平头峰、峰高超过2000mAU或峰很高的同时又前拖、后拖得很厉害通常都认为是过载的，但

　　8、这一点也并不绝对，因为不同化合物的吸收强度不一样，如果一种化合物在某一波长处有强吸收，即使出现了平头峰，样品也不一定过载，这与仪器和软件有关；相反如果吸收弱，则高浓度条件下峰也不见得有多高；所以样品是否过载应该结合浓度、进样体积和峰形一起来判断。通常认为峰高在100mAU左右比较合适，不至于因过载影响峰形。由于样品过载引起的峰形后拖不容易消除，也可能根本无法消除，继续采用以下的峰形改善措施可能不会有什么作用，而且在过载的情况下无法看清正常浓度时样品真实的分离状况和峰形，因此需要优先考虑是否过载，否则继续往下调整峰形的努力将无任何意义。如果发现过载，需降低进样量（包括进样体积或浓度），但不管怎么

　　9、样，减少进样量通常对改善峰形总是有益的，一般而言，进样量越小，峰形越好，例子如头孢尼西钠的测定：色谱柱：Ultimate XBC18，5um，4.6250mm；波 长：272nm；流动相：0.01mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节pH3.5）：乙腈84：16； 温 度：室温17； 流 速：1.0ml/min；进样量：20ul；2. 往流动相中加入酸根据这一解释，往流动相中加酸将流动相的pH调至2.5以下有助于改善峰形，这种方式，主要用于改善对带羧基化合物的拖尾，例子如二甲基苯氧乙酸的测定：色谱柱：Ultimate XBC18，5um，4.625

　　10、0mm； 波 长：280 nm； 磷酸盐缓冲溶液的配制：准确称取磷酸二氢钠7.8g溶于1000ml水中，搅拌均匀，使之溶解，用磷酸将pH值调至2.50； 温 度：室温26；流 速：1.0ml/min；进样量：20ul；由谱图可以看出，分析二甲基苯氧乙酸时流动相中加酸调节pH至2.49改善了峰形，加入酸的作用是，一方面抑制了硅羟基的离子化，另一方面也抑制了有机酸的离子化，因而削弱了COO与SiOH的相互作用，减小了拖尾。碱性化合物中，容易发生拖尾的化合物中通常包含着NH2、NHR、NR2，即伯、仲、叔三种富电荷的极性基团，它们的碱性强弱顺序为：NH2 NHR NR2，其碱性强

　　11、弱跟与N原子直接相连的基团有关，吸电子基团会削弱这种碱性，供电子基团（如烷基）则使之增强。伯氨中甲胺的碱性最弱，以它为例更具有代表性，甲胺的pKa为10.64，那么在pH 8.64的时候它是完全呈离子态的，也就是NH3，那么pH在2.58.64时，特别是pH6.78.64时，因为此时带氨基的化合物和硅羟基均以离子状态NH3和SiO形式存在的，它们之间相互吸引的静电作用导致后拖，这就是为什么很多碱性化合物在pH 7.0的条件下容易产生拖尾的原因，而很多色谱柱生产商也因此以阿米替林（含N(CH3)2，碱性比NH2强）在pH 7.0的条件下来评价和比较不同色谱柱之间的优劣，该条件下的阿米替林

　　12、的峰形越好说明封尾越好，封尾工艺成功的阻止了残余硅羟基与样品分子的接触。而在pH2.5的条件下，也仍然后拖，是因为NH3足够强，即使硅羟基以分子状态存在也仍能够与SiOH中氧原子产生吸引作用，导致峰形拖尾。当pH12.64的时候，甲胺完全以分子状态形式存在，不会引起拖尾。所以分析有些化合物，流动相的pH需要调至强碱性条件下峰形才会变好。 3. 增加缓冲盐或增大缓冲盐的浓度：流动相中加入缓冲盐，增强了流动相的离子强度，在NH3等极性基团和硅羟基SiO之间存在着许多离子的干扰，减少了样品分子与硅羟基之间相互接触的机会，有助于削弱极性基团与硅羟基之间的相互作用，改善峰形。这种适合于碱

　　13、性较弱（如氨基的N原子与强吸电子基相连），或碱性很强，但在刚性结构中，比较难以接近被C18长链和封尾试剂覆盖的硅羟基，例子如高乌甲素的测定：虽然加入了三乙胺，但加入的量非常少，200ml混合好后的溶液中，只加入了75ul滴用于调节pH的（因为不调节pH，保留时间太短，在4.2min出峰），相对于2的浓度的量而言75ul是非常少的，几乎起不到屏蔽硅羟基的作用，因此，上图中峰形改善的原因，主要的应归功于缓冲盐的加入。4往流动相中加入三乙胺基于上面的解释，既然拖尾的产生是因为NH2、NHR、NR2与硅羟基发生静电作用引起的，那么阻碍它们之间静电作用的途径，应该有两种，一种是占据硅羟基这个作用位点，另

　　14、一种是占据NH2、NHR、NR2这个作用位点。 在流动相中加入三乙胺，能显著的改善峰形，消除拖尾。其作用是屏蔽硅羟基，使碱性化合物在分离的过程中减少了和硅羟基相互接触的机会，失去了导致拖尾的作用位点。三乙胺的pKa为11.09，在pH11.0929.09的条件下是以离子状态NH(CH2CH3)3的形式存在的，因此pH在2.58.64 硅羟基呈SiO离子态的情况下，NH(CH2CH3)3容易与SiO形成相对较强的静电吸引力，流动相中加入了三乙胺后，平衡柱子的过程中已经优先占据了硅羟基的作用位点，而带氨基的样品分子虽然在该pH条件下也呈离子状态NH3、NH2R或NHR2 ，也能与SiO形成

　　15、相对较强的静电吸引力，但三乙胺有先占住位点的优势，使样品分子与硅羟基的作用大大减弱，缓解了拖尾的产生；同时，流动相中存在的NH(CH2CH3)3 仍然与样品分子中的极性基团与硅羟基的相互作用产生竞争，更进一步的削弱了样品分子与硅羟基的接触机会，改善峰形。例子如：头孢噻肟钠的测定：通常加入三乙胺的量约为2即有显著的效果，如有需要可适当增大用量。加入三乙胺改善峰形的时候，有两点需要注意的：1）三乙胺的碱性很强，加入三乙胺后流动相的pH可能超出色谱柱的使用范围，对色谱柱造成损伤，同时，pH的改变也会导致出峰时间的显著变化，为了避免保留时间变化太大而可能引起的其它问题，因此，建议流动相中加入三乙胺后回

　　16、调至未加入前的pH值，但通常即使pH回调过也仍会引起保留时间的较大变化；2）三乙胺在210nm处有比较强的吸收，如果液相方法中检测波长在210nm以下测定时需要谨慎使用，以免因加入三乙胺后本底上升，而引起峰高、峰面积下降，检测灵敏度严重降低，有些甚至看不到峰，例子如地红霉素的测定：第二个图中连进了两针都没有峰出现，这种现象得到了重现性。由此可见，三乙胺用于改善峰形，其使用范围是有一定限制的。峰形前拖解决方案和实例 峰形对称性的优劣对峰面积和分离度有很大的影响，从而影响分析结果的准确性，是色谱工作者不得不重视的问题，也是让大家最为头疼的问题之一。然而引起峰形异常的因素很多，如色谱柱本身装填不好、

　　17、强保留化合物对色谱柱的污染、填料中残留硅羟基引起的次级保留效应、柱头塌陷、柱外死体积等等，针对不同的情况我们可以有不同的对策。在这里我们撇开所有的污染、塌陷、死体积等其它因素，假设系统是好的，柱子是新的、好的，单纯探讨液相方法与峰形前拖之间的关系，通过调整液相方法来解决峰形前拖的问题。前拖峰在谱图上有几种表现形式，主要有以下3种，第一种比较明显一些，后两种，容易让人怀疑这个峰里面是不是有两种物质没有彻底的分开，第三种前拖更是让人质疑是否是色谱柱受到了污染引起的肩峰。发现峰形前拖时，本人建议按下面的步骤逐步排除可能的原因，然后找到相应的对策，消除峰形前拖的状况、改善峰形。1）先检查一下是否是样品

　　18、过载样品过载，通常会引起峰形变差，导致前拖、后拖或平头峰，如果出现平头峰、峰高超过2000mAU或峰很高的同时又前拖、后拖得很厉害通常都认为是过载的，但这一点也并不绝对，因为不同化合物的吸收强度不一样，如果一种化合物在某一波长处有强吸收，即使出现了平头峰，样品也不一定过载；相反如果吸收弱，则高浓度条件下峰也不见得有多高；所以样品是否过载应该结合浓度、进样体积和峰形一起来判断。通常认为峰高在100mAU左右比较合适，不至于因过载影响峰形。由于样品过载引起的峰形前拖不容易消除，也可能根本无法消除，继续采用以下的峰形改善措施可能不会有什么作用，而且在过载的情况下无法看清正常浓度时样品线、峰形，因此需要优先考虑是否过载，否则继续往下调整峰形的努力将无任何意义。2) 检查是否是用流动相溶解样不用流动相溶解样品容易在谱图上产生溶剂峰和前拖（上述的几种形状的前拖都有），这种情况通常是在溶解样品的溶剂（如纯甲醇）洗脱能力比流动相（如甲醇：0.4%磷酸溶液38：62）强的情况下发生，如例2，而溶剂洗脱能力比流动相相对较弱时，目前未见此现象；也有人说也会产生后拖，但本人做样以来并没有碰到过这种的情况。正常的峰形应该是样品在色谱柱上均匀的前移的情况下得到的，浓度分布在整个通过色谱柱柱床的过程中任何时候都呈正态分布，如下图所示：为什么用洗脱能力比流动相强的溶剂溶解样品会容易产生前拖？以“姜黄素

　　20、标准品的测定”为例，样品溶剂是甲醇，流动相为乙腈：4%冰醋酸水溶液48：52，直接进样时表现出前拖，如下图a；用流动相溶解样品后前拖消失，峰形对称，如下图b：一种可能的解释是，进针后，在流动相的推动下样品溶液很快到达色谱柱，此时样品溶液未能被流动相很快稀释，结果是，作为样品溶剂的局部浓度过大，由于甲醇的洗脱能力比流动相强，因此甲醇带着部分样品提前进入到了填料里面，而另一部分则还没来得及进入填料周围的环境就发生了变化由甲醇变成了流动相，所以一部分样品提前被甲醇带出来而另一部分没有，导致样品谱带的浓度分布发生了变化，浓度中心偏离了正常峰时的位置。同时作为样品溶剂的甲醇毕竟有限，只有几十微升，因此只

　　21、能带着很少一部分样品提前进入填料，形成前拖；根据这一解释，出现这种前拖时，似乎样品只有在周围环境与流动相相同时才不会发生这种现象，如果用甲醇溶解的样品浓度为10ug/ml时出现前拖（此时样品周围环境与流动相不同），那么将1000ug/ml高浓度甲醇溶解的样品用流动相稀释至原来浓度的1/100倍（此时样品的浓度也为10ug/ml，周围环境与流动相也不完全相同），是不是也会出现前拖呢？很显然不会，因为它和用流动相溶解已经没有什么区别，差异太小了，只有1/100。也就是说不一定非得用流动相溶解样品才会消除这种因样品溶剂而引起的前拖，那么到底要与流动相差异多小才不会引起这种状况呢？在我们的实验过程中发

　　22、现，只要用流动相将原样品稀释至原来浓度的1/4倍（体积比，原样品溶液：流动相1：3混合）就可以达到和用流动相溶解相似的效果，例子如下：石杉碱甲标准品的测定色谱柱： Ulitmate XBC18，4.6250mm； 流动相：甲醇：缓冲盐溶液25：75； 缓冲盐溶液的配制：（配制0.08M醋酸铵水溶液，再用冰醋酸调节PH至6.0）；检测波长：308nm； 温度：室温26 度； 流速: 1 ml/min； 进样量：20ul；由此可以看出，不用流动相溶解样品对色谱峰形是有很大影响的，容易造成前拖，所以特别是开发方法的时候尽量使用流动相来溶解样品。当然，如果已经用了较强的溶剂溶解样品，得到了

　　23、一个前拖峰，而重新用流动相配制样品又很麻烦时，那么可以用流动相将样品稀释至原来浓度的1/4倍，来粗略的考查一下，看是否是因未用流动相溶解引起的。事实上，一直以来我们在考查峰形前延引起的原因的时候经常用这种更便捷的方式，省了不少时间，非常管用。 有时候同样是用强溶剂溶解的在有些色谱柱中产生前拖，而另一些色谱柱中没有，我个人认为，这些填料可能是没有封尾的，从填料键合的角度，裸硅胶上键合上C18长链后仍然残留了大量的硅羟基，残留的硅羟基对水分子具有很强的吸附能力，硅胶表面的吸附水对所进的样品溶液产生了一种稀释作用，使附带样品的甲醇失去了相对较强的洗脱能力，不再能很快带着部分样品进入填料，而是均匀的进

　　24、到色谱填料中，样品在色谱柱中的浓度分布未能产生偏移，因而出来的是正常峰。如果峰形仍然前拖则继续往下调整。3）增加流动相中缓冲盐的浓度增加缓冲盐浓度可以增大流动相中的离子强度，减少因静电的作用（有可能存在于样品分子之间、也有可能存在于样品分子与填料表面之间）引起的前拖。例子如下：注射用苦参碱的测定色谱柱：Ultimate XB-NH2-2, 5um, 4.6250mm； 柱 温：室温24度； 流速：1.0ml/min； 检测波长：220nm； 进样量：20ul；4）流动相中加入适量的四氢呋喃往流动相中加入少量的四氢呋喃有时可以改善峰形、增大分离度，很多色谱工作者都知道和使用，但其机理

　　25、似乎少人提及。通常所加入的量在5以内即可，需要的时候可以加入更大的量。例子如下：阿莫西林胶囊的测定色谱柱：Ultimate AQC18，5um，4.6250mm； 检测波长：254nm； 温度：室温28度； 流 速：1.0ml/min； 进样量：20ul；5）升高柱温升温有助于增加流动相传质速率，减少因静电作用引起的前拖，但温度不宜太高，温度太高容易损伤色谱柱，特别是含有离子对试剂的时候，最好不要超过40度。高效液相色谱峰形前延分析及解决方案怀化市药品检验所 唐勇2010年10月21日 峰形对称性的优劣对峰面积和分离度有很大的影响，从而影响分析结

　　26、果的准确性。然而引起峰形前延异常的因素很多，如色谱柱本身装填不好、强保留化合物对色谱柱的污染、填料中残留硅羟基引起的次级保留效应、柱头塌陷、柱外死体积等等，针对不同的情况我们可以有不同的对策。撇开所有的污染、塌陷、死体积等其它因素，假设系统是好的，柱子是新的、好的，单纯探讨液相方法与峰形前延之间的关系，通过调整液相方法来解决峰形前拖的问题。 1、样品是否过载 降低进样浓度，看峰形是否有所改善。一般认为峰高在100mAU左右比较合适，不至于因过载影响峰形。 2、检查是否是用流动相溶解样品 溶解样品的溶剂（如纯甲醇）洗脱能力比流动相强会发生峰前延

　　27、。具体机理是：正常的峰形应该是样品在色谱柱上均匀的前移的情况下得到的，浓度分布在整个通过色谱柱柱床的过程中任何时候都呈正态分布。样品溶液进样后到达色谱柱时间很短，应还未被流动相充分稀释，洗脱能力更强的样品溶剂的局部存在，将使部分样品被洗脱的速度加快，导致峰前延。例如：栀子中栀子苷的测定。 3、增加流动相中缓冲盐的浓度 增加缓冲盐浓度可以增大流动相中的离子强度，减少因静电的作用（有可能存在于样品分子之间、也有可能存在于样品分子与填料表面之间）引起的前延。例如：注射用苦参碱的测定。 4、流动相中加入适量的四氢呋喃 往流动相中加入少量的四氢呋喃有时

　　28、可以改善峰形、增大分离度，通常所加入的量在5以内即可，需要的时候可以加入更大的量。例子如下：阿莫西林胶囊的测定。 5、升高柱温 升温有助于增加流动相传质速率，减少因静电作用引起的前拖，但温度不宜太高，温度太高容易损伤色谱柱，特别是含有离子对试剂的时候，最好不要超过40度造成色谱峰（不对称）拖尾的原因1.色谱柱本身填装问题，筛板堵塞或填料塌陷；2.柱头有污染；3样品超载；4样品溶剂不合适；5.柱外效应；6化学或二次保留（硅羟基）效应；7缓冲容量不足或不合适；8重金属污染。如何解决峰形拖尾的问题A与化学有关的拖尾问题1流动相中，加入30mM的三乙胺（用与碱性化合物）或醋酸

　　29、胺（用与酸性化合物），未知化合物加醋酸三乙胺；2如仍然拖尾，将三乙胺换为二甲基辛胺（或醋酸二甲基辛胺）；3降低进样量至1ug。B与色谱柱有关的拖尾问题1如柱头处有强保留的样品组分积聚，反相柱可用20倍柱体积的96%的二碌甲烷与4%甲醇，加1%氢氧化铵混合液冲洗，正向柱可用甲醇冲洗。2使用保护柱C与HPLC 系统有关的峰拖尾和峰加宽1进样体积过大，（通常25uL）；2进样阀与色谱柱及检测器之间的管路体积过大（最佳连接管应20cm，内径为0.007）；3检测器流通池的体积过大。液相色谱柱使用问题解析色谱柱 2010-08-26 17:01:09 阅读3422 评论4 &

　　30、#160;字号：大中小订阅 液相色谱柱使用疑难问题解析 就液相色谱柱的安装，使用和维护知识，以及各种柱压、峰形和色谱柱寿命等问题前来提问，也欢迎液相色谱方面的高手前来交流切磋。内容提纲：一、 液相色谱柱的安装、启用和维护中的重点注意事项1、柱头类型和不锈钢毛细管接头的匹配2、溶剂的匹配转换3、新柱使用前的平衡和老化4、pH使用范围5、色谱柱的保存二、柱压问题1、填料破碎和使用后，有填料粉末生成2、颗粒物堵塞引起柱压上升和对策 1）预防措施 2）故障排除3、化学污染物引起柱压上升和对策

　　31、 1）预防措施 2）故障排除三、峰形问题1、峰后拖2、峰前延3、 其他峰形问题四、保留时间问题1、 保留时间的重现性2、 保留时间漂移3、 柱与柱之间的重现性4、 批与批之间的重现性五、寿命问题六、其他疑难的色谱技术问题 一.安装、启用和维护中重点注意事项 色谱柱既是液相色谱仪的最核心部件，价格相对昂贵，请牢记它是高档仪器中的高档部件，给它以足够的尊重和关怀。如避免强烈的碰撞和震动，尽管色谱柱从1米高的实验台掉落到水泥地上不至于100%会损坏，但50%的可能损坏你也承受

　　33、0; 1.柱头类型和不锈钢毛细管接头的匹配 色谱柱是消耗品，不是仪器原配的情况很多。上图表明柱连接的6种不同方式（数字单位是英寸），如果两者类型不匹配将会产生漏液或者死体积过大的现象。接头比柱头深度长，不易拧紧而漏液；接头比柱头深度短，柱头内留有空隙而产生死体积，使谱带展宽和峰拖尾。2.溶剂的匹配转换 色谱柱内保存溶剂和仪器系统内存留溶剂，如果和流动相不匹配，使用前需进行转换。特别是流动相含缓冲盐时，如保存溶

　　34、剂是纯有机相或有机相比例高，直接将新柱接入使用，会导致缓冲盐在柱内结晶析出，最严重会将新柱永久不可逆地损坏。正相柱保存溶剂一般为正己烷，如果要转换成HILIC柱模式使用，由于正己烷和甲醇乙腈的互溶性不好，转换中间需用二氯甲烷或乙酸乙酯过渡。3.新柱使用前的平衡和老化 厂家出厂检验时一般都已进行过平衡，但色谱柱到最终用户时间不一，用户正式测定前最好对色谱柱再次平衡。最好的平衡兼老化一起进行的方法是运行几次完整的分析程序（包括进样），直到观察到峰形、保留时间和峰面积稳定为止。所谓“老化”是借用了气相的术语，目的是达到分析物在色谱柱以及整个液相系统流

　　35、路中的吸附饱和。对某些特定的待测物，如分子量大于1000的，因扩散速度慢，老化时间相应要长，可采取大浓度进样或在同一个洗脱周期内连续进样多针的方式加快老化。4.pH使用范围 一般认为硅胶基质柱子的pH使用范围是2-8，这是很粗略的。硅胶类型、使用温度、硅胶表面所键合的固定相类型以及缓冲盐的不同，对此均有影响。硅胶比孔容小、键合密度大的填料pH耐受范围要大一些，如月旭公司的Ultimate XB-C18色谱柱，选用的是高品质硅胶，加上高密度键合和双封尾，使pH耐受范围最大提高到10。磷酸盐缓冲盐渗透力强，有加快硅胶溶解的副作用，它的存在会降低pH

　　36、使用范围。有机杂化硅胶以及硅胶表面涂覆杂化层的硅胶填料，有机质的存在使pH使用范围能到12以上，月旭公司的Xtimate系列产品即属此类。5. 色谱柱保存 短期保存(隔夜或隔周末)用所用的流动相（不含缓冲盐）保存为佳，以尽量减少下次使用的平衡时间。一般只建议在长期保存反相柱的时候用纯甲醇或乙腈，一方面纯有机相保存有最大限度减少键合相水解的作用，但纯甲醇（乙腈）又会将已水解而暂时吸附在柱内的键合相洗脱出去，使固定相流失进程加快，寿命缩短。纯有机相保存还有易挥发使柱床变干的缺点，使用80%左右有机相保存也属好的选择，且足以避免长菌。强烈建议在柱身上贴

　　37、标签标明保存溶剂。 CN基柱在有机极性溶剂中柱床不稳定（会导致柱床结构坍塌），适合在水相中低温保存。低温保存要确保不发生固定相冻结而损坏柱床。离子交换柱和水性SEC柱等适合保存在水溶液中的色谱柱，可加0.05%叠氮化钠溶液防止长菌。 正相柱，无论是短期还是长期，都推荐保存在所用流动相中。上面是基本色谱分离方程式，分离度R和柱效（N）、选择因子（?）以及容量因子k相关，和柱压无关。 但柱压（P）仍不失为 HPLC方法中的最重要参数之一，因为柱压反映了色谱柱的内部状况。 现今能承受400 bar压力的

　　38、HPLC泵很常见，色谱柱如在远低于上限的压力下正常运行，不需要我们重点关注；当柱压升高接近上限或者柱压有异常升高，往往意味着色谱柱出状况了，需及时进行维护和补救，严重时色谱柱就已报废了。本节将详细考察柱压问题并提出可行的解决方案。柱压方程 对填充色谱柱，柱压与黏度 ()、柱长 (L)和流速 (F)成正比，与填料粒径（d p）以及柱管半径（r）的平方成反比。K0是比渗透性系数，对填充床，其值约为0.001。通过此公式可近似计算出给定色谱条件下的理论柱压。只有当新柱实际测得的柱压和理论柱压相差很大，才能说柱压存在问题。 黏度 ()取决

　　39、于流动相溶剂的选择，为降低柱压，反相色谱中倾向于选择低黏度的乙腈，而不是高黏度的异丙醇。当然选择时还需考虑溶剂强度、极性、分析物的溶解度以及和分析物兼容性等。 柱长（L）增加可以提高分离度（R），流速（F）提高能加快分离，但都会导致柱压上升，选择确定这些运行参数时，需综合平衡和折中。 填料粒径对柱压影响极大，d p降低一倍，柱压将增加4倍。UHPLC中采用的sub-2 m填料，柱压超过普通HPLC泵的400Bar上限很多。提高柱温因可降低黏度，相应降低柱压。在梯度洗脱时，黏度随流动相组成的变化而改变，柱压也会处在不断变化中。对水/甲醇流动相体系，在55：45时，黏度和

　　40、柱压有个极大值。 内径的影响同样很大，根据线流速相同柱压相同的原则，4.6mm内径的色谱柱流速为1ml/min，约相当于在2.1mm内径色谱柱上的0.2ml/min流速，在10mm半制备色谱柱上的5ml/min，计算公式为v1.0ml/min x（内径r/4.6）2。所以在换不同内径色谱柱时，请及时调整流速，以免因高柱压损伤色谱系统。 柱压下降是仪器系统的连接有泄漏，柱压不稳定一般认为是流路中有气泡或空穴，和色谱柱相关的柱压问题是柱压上升。色谱柱结构: 和柱压相关最大的是进口端筛板（inlet frit）

　　41、以及其后面1-2cm长度的柱头填料。筛板上有比填料粒径小的小孔，筛板上的小孔或柱头填料的间隙被部分堵塞，是柱压上升的主要原因。有以下几类情况：1.填料破碎和使用后有填料粉末生成填料破碎一般在装柱过程中发生，装柱压力过大或所选硅胶机械强度过低所至，设定柱压出厂标准可解决；流动相中高pH值缓冲盐使硅胶溶解并重新形成填料粉末，堵塞出口端筛板，这种情况下反冲不起作用，只有更换后筛板，不过打开承压的后筛板，对柱床会有不好影响。2. 颗粒物堵塞引起柱压上升和对策 可能堵塞进口端筛板（前筛板）和柱头填料间隙的颗粒物来源有：样品（制样时灰尘和滤纸等带入）、进样

　　42、阀密封圈磨损、流动相（溶剂本身含有和配制过程进入）、液相仪器中泵阀密封圈的磨损、缓冲盐析出（一般在梯度运行和进样时盐的溶剂环境改变导致）。 水和缓冲盐流动相内生长的细菌，也是颗粒物来源的一种，可堵塞筛板和填料间隙。应避免将这类流动相在室温下久放，可放入冰箱存放。1) 预防措施 样品（甚至标准品）和流动相过滤，既预防了筛板、柱头和毛细管堵塞，又能减少进样阀、活塞杆和截止阀等仪器关键部件的磨损。普通用0.45um孔径滤膜过滤样品和流动相，对使用2um以下填料的超高压柱的，可用0.20um滤膜。滤膜材质有再生纤维素、聚四氟乙烯、尼龙、硝酸纤维和醋酸

　　43、纤维等，须根据和样品溶剂及分析物的适应性慎重选择。 使用保护柱或在线过滤器，具体安装位置见下图：在线过滤器内装有可更换的滤片，滤片孔径一般有2um和0.5um两种。安装位置有两个可选择，在进样器和色谱柱之间时，对样品和流动相中的颗粒物都有效；在泵和进样器之间，则只对流动相有过滤作用。保护柱是缩小版的色谱柱，内含带填料的可更换的柱芯，安装在进样阀和色谱柱之间，用于防止色谱柱的化学污染为主，也有过滤颗粒物的作用。2)故障排除 反冲色谱柱：不连接检测器，直接将堵在前筛板上的颗粒物冲出排到废液瓶中。开始时反冲压力可低于正常使用

　　44、压力，待颗粒物有冲出后，逐步提高冲洗压力。有时颗粒物已非常牢固嵌入到筛板内部，反冲不一定凑效，早反冲、勤反冲相对效果更好。有的厂商为避免堵塞，使用了较大孔径（2-5um）的前筛板，这种情况反冲会将填料冲出。换筛板：一般不建议这样做，因为换筛板会带走粘在筛板上的部分填料，使柱床的均一性受影响，导致柱效下降。不过如果反冲不能解决问题，也只能不得已而为之，要不然就要把色谱柱报废了。 如果系统中不接色谱柱，柱压仍然高，说明泵出口到色谱柱之间的其它部位，包括进样器、在线过滤器和保护柱等有堵塞，可逐一排查。为了减少死体积，毛细管都做得尽可能的细，也可能被堵。3. 化学污染物引起柱

　　45、压上升和对策 来源同样是样品、流动相和系统，不过来源于样品的污染最普遍，特别是对复杂基体样品未经前处理或前处理不够的时候。化学污染物主要有：分子量很大的化合物、盐类、脂质、蜡类、油脂、腐殖酸、蛋白质等其它生物来源的物质。 像盐类这样的保留能力极小的污染物会在死体积处很快从柱中洗脱出去，检测器一般对此类物质响应不大，有时表现为干扰峰、基线波动、斑点甚至负峰。 保留能力中等的污染物，会被慢慢洗出色谱柱，表现为宽峰、基线馒头形波动和基线; 对强保留的污染物，一般流动相强度不足以将其从柱中洗

　　46、出，会逐步在柱头累积。有时，累积在柱头的污染物可作为新固定相对分析物起作用，引起保留时间改变、峰拖尾和峰分叉等。污染物在柱头累积到一定程度，如果不采取措施，会堵塞填料间隙，引起柱压上升。最好的办法是选用合适的溶剂冲洗溶解这些物质，同时又不对填料本身有损害。如聚合物柱中累积的蛋白类污染物可用pH13-14的强碱溶液洗掉，但这种方法不适合硅胶基质色谱柱。1）预防措施：a制样时采用SPE固相萃取等方法，预先将色谱柱杀手类的污染物质清除掉；b连接保护柱。保护柱是分析柱的延伸，在填料类型和粒径上应于分析柱一致，才能最大限度起保护作用，又不影响色谱性能。一个设计和装填良好的保护柱，还可增加分析柱的分离效率

　　47、。如果因某种原因需在保护柱中用不同的填料，也应选择比其所保护的分析柱保留能力弱的固定相，这时的保护柱完全用于截住强保留物质，类似于SPE小柱的功效。当保护柱柱芯保护功能用尽时，也不能说不可再清洗后复用，但价格低不值得去花这个时间。c经常对分析柱进行冲洗维护：2)故障排除： 已经累积很多污染物，用甲醇或乙腈简单冲洗不奏效，推荐使用下面方法清洗反相柱100甲醇-100乙晴-75乙晴/25异丙醇-100异丙醇-100二氯甲烷-100正己烷 用每种溶剂冲洗至少10个柱体积，对于250mm4.6mm的分析柱，合适的冲洗流速是12ml/min

　　48、。最后用10柱体积的异丙醇过渡，然后回到原来的流动相体系。 对受蛋白类污染的硅胶基质反相柱，纯有机溶剂如乙腈或甲醇不能溶解多肽和蛋白质。由有机溶剂、缓冲液和酸,有时还加上离子对试剂等组成的配方清洗效果极佳，譬如用三氟乙酸水溶液和三氟乙酸/丙醇溶液对柱子重复进行梯度洗来再生；Bhadwaj和Day试验了在250mm46mm的柱子中注入100L的三氟乙醇，再生效果良好。 清洗硅胶、CN和Diol等正相柱建议方法：先用20柱体积50：50正己烷/氯仿冲洗，然后用甲醇、二氯甲烷或者100%醋酸乙酯冲洗。对油脂类物质，可用异丙醇清洗。

　　49、60; 峰形对称性的优劣对峰面积和分离度有很大的影响，从而影响分析结果的准确性。引起峰形异常的因素很多，柱外死体积引起峰形异常有个特点：对先出的峰影响大，对后出峰影响小；柱头塌陷、柱头和筛板污染会引起所有的峰形都异常，而硅醇基次级保留只引起部分峰拖尾。相塌陷除了引起保留下降外，也会造成峰拖尾。色谱实践中，大部分的峰形问题都不是色谱柱的问题，仪器参数设定、色谱条件和方法正确与否对峰形有很大影响。1.峰后拖常见的3种拖尾情况：次级保留引起峰拖尾的机理解析：反相色谱中，通常非极性和弱极性的化合物能获得良好的峰形，而带有COOH、NH2、NHR、NR2等

　　50、极性基团的化合物则比较容易产生拖尾，原因是硅胶表面残留硅羟基对极性和碱性样品分子产生次级保留效应。 反相填料表面有残余的硅羟基，具有一定的酸性，其pKa约为4.54.7。根据电离规律，流动相的pHpKa2即pH6.7时，99以上的硅羟基应该是呈离子状态的，即SiO ，而pKapH2即pH2.5时，酸性环境抑制了硅羟基的电离，99以上的硅羟基应该是呈分子状态的，即SiOH，但其极性仍然存在，即SiOH。SiOH和SiO对于极性化合物之间的作用力则是一种极性的静电作用力，这种作用力比范德华力要强得多。同时，因为硅胶表面键合了C18长链，由于

　　51、空间位阻作用，样品分子中能接触到残余硅羟基的机会不多，只有少部分的分子才能与残余硅羟基产生强的静电作用而被推迟洗脱出来，产生后拖。拖尾严重的程度与样品分子极性大小和残余硅羟基的多少有着直接的关系。 上图是填料表面的示意图，完全硅羟化的硅胶表面硅羟基浓度为8?mol/m2，由于空间位阻的作用，通常与C18硅烷基发生反应的仅达23.5?mol/m2，需要再用小分子的硅烷跟硅羟基反应，如图中的三甲基氯硅烷，使硅羟基中的氢变成了三甲基硅烷的一个惰性基团。三甲基硅烷还是比氢原子大得多，还是不能将所有的残余硅羟基的活性封闭掉。 相同的样品在不同品牌的柱子

　　52、上产生拖尾的严重性不同，从填料合成的角度而言就是键合密度是否高、封尾是否彻底，高密键合和彻底的封尾能显著减少这种机会，获得良好的峰形。Welch公司Ulimate品牌的XBC18、AQC18和Xtimate C18采取的就是高密键合和彻底的双峰尾工艺。解决方案：1）先检查样品是否过载，由于样品过载引起的峰形后拖不能通过改变色谱条件消除。如果发现过载，需降低进样量（包括进样体积或浓度），进样量越小，峰形越好，例子如头孢尼西钠的测定：2）调节流动相pH将流动相的pH调至比弱酸pKa小2以上，比弱碱pKa大2以上，可有效抑制易离子化待测物的电离，从而取得良好峰形。例子如二甲基苯氧乙酸的测定：

　　53、0; 碱性化合物中，甲胺的pKa为10.64，那么在pH 8.64的时候它是完全呈离子态的， 那么pH在2.58.64时，特别是pH6.78.64时，此时甲胺和硅羟基均以离子状态NH3和SiO形式存在的，它们之间相互吸引的静电作用导致后拖，这就是为什么很多碱性化合物在pH 7.0的条件下容易产生拖尾的原因。而很多色谱柱生产商也因此以阿米替林（含N(CH3)2，碱性比NH2强）在pH 7.0的条件下来评价和比较不同色谱柱之间的优劣，该条件下的阿米替林的峰形越好说明封尾越好。而在pH2.5的条件下，也仍然后拖，是因为NH3足够强，即使硅羟基以分子状态存在也仍能够与Si

　　54、OH中氧原子产生吸引作用，导致峰形拖尾。当pH12.64，大于pKa2以上时，甲胺完全以分子状态形式存在，不会引起拖尾。3）增加缓冲盐或增大缓冲盐的浓度： 流动相中加入缓冲盐，增强了流动相的离子强度，在NH3等极性基团和硅羟基SiO之间存在着许多离子的干扰，减少了样品分子与硅羟基之间相互接触的机会，有助于削弱极性基团与硅羟基之间的相互作用，改善峰形。这种适合于碱性较弱（如氨基的N原子与强吸电子基相连），或碱性很强，但在刚性结构中，比较难以接近被C18长链和封尾试剂覆盖的硅羟基，例子如高乌甲素的测定：4）加入三乙胺、四丁基硫酸氢铵或辛烷磺酸钠等 &#

　　55、160; 拖尾的产生是因为NH2、NHR、NR2与硅羟基发生静电作用引起的，那么阻碍它们之间静电作用的途径，应该有两种，一种是占据硅羟基这个作用位点，另一种是占据NH2、NHR、NR2这个作用位点。 在流动相中加入三乙胺，能显著的改善峰形，消除拖尾，其作用是屏蔽硅羟基。三乙胺的pKa为11.09，在pH11.0929.09的条件下是以离子状态NH(CH2CH3)3的形式存在的，因此pH在2.58.64 硅羟基呈SiO离子态的情况下，NH(CH2CH3)3容易与SiO形成相对较强的静电吸引力。 加入三乙胺改善峰形的时候，有两点需要注意

　　56、：1）三乙胺的碱性很强，加入三乙胺后流动相的pH可能超出色谱柱的使用范围，对色谱柱造成损伤。pH的改变也会导致出峰时间的显著变化，可能引起的其它问题，建议流动相中加入三乙胺后回调至未加入前的pH值。通常即使pH回调过后，由于三乙胺成为了固定相的一部分，保留时间也有较大变化；2）三乙胺在210nm处有比较强的吸收，如果液相方法中检测波长在210nm以下测定时需要谨慎使用。 四烷基季铵盐（如四丁基硫酸氢铵、四丁基溴化铵、四丁基氢氧化铵等）在水中电离后，也形成了类似NH(CH2CH3)3的结构N(CH2CH2CH2CH3)4 ，这种结构也能有效的与SiO产生较强的静电作用，

　　57、阻止氨基与硅羟基的接触，改善峰形。而且它还有一个不同于三乙胺的显著特点是，它在低波长范围的吸收比三乙胺弱。 流动相中加入辛烷磺酸钠等烷基磺酸盐离子对试剂也能很好的改善峰形，其作用机理与三乙胺和四丁基硫酸氢铵颇为不同，是通过与样品分子的作用来阻止样品分子与硅羟基的作用来改善峰形。2峰前延峰前延发生的概率比较小，下面是三种前拖峰的表现形式： 造成前延峰的原因有多种，我们可依次逐一排查：1）样品是否过载 降低进样浓度，看峰形是否有所改善。一般认为峰高在100mAU左右比较合适，不至于因过载影响峰形。2) 检查是

　　58、否是用流动相溶解样品 溶解样品的溶剂（如纯甲醇）洗脱能力比流动相强会发生峰前延。具体机理是： 正常的峰形应该是样品在色谱柱上均匀的前移的情况下得到的，浓度分布在整个通过色谱柱柱床的过程中任何时候都呈正态分布。样品溶液进样后到达色谱柱时间很短，应还未被流动相充分稀释，洗脱能力更强的样品溶剂的局部存在，将使部分样品被洗脱的速度加快，导致峰前延。3）增加流动相中缓冲盐的浓度 增加缓冲盐浓度可以增大流动相中的离子强度，减少因静电的作用（有可能存在于样品分子之间、也有可能存在于样品分子与填料表面之间）引起的前延。例如：注射用苦

　　61、; 进样量：20ul；5）升高柱温 升温有助于增加流动相传质速率，减少因静电作用引起的前拖，但温度不宜太高，温度太高容易损伤色谱柱，特别是含有离子对试剂的时候，最好不要超过40度。 柱头污染和柱头塌陷都会造成裂峰，最常见的原因是筛板上颗粒物堵塞样品进入色谱柱不均一，只需反冲色谱柱将颗粒物除掉就可解决。 分保留时间重现性和保留时间单向漂移两类。1.保留时间的重现性 在色谱分析中最重要的是分离选择性，保留时间的重现性则是可简单通过用峰面积定量代替峰高定量来消除其对分析结果的影响。温度、

　　62、流动相组成、pH、离子强度等的微小变化都会引起保留时间的改变。10-20柱体积流动相平衡是必须的。三乙胺等添加剂加入，平衡时间需加长。 固定相流失： 1) 在酸性条件下键合相碳链水解断裂流失； 2)碱性条件下硅胶基质溶解导致在基质上键合固定相流失； 3)p H2-8下，上述两种因素导致的流失仍会缓慢发生。多位键合比单点键合好，长链比短链键合牢固，用于封尾的键合相易流失；C18链的稳定性比CN基链大三个数量级，一个是3个月会有明显流失，一个是1小时；用有机相洗柱子会加快流动相的流失。 

　　63、; 柱污染：污染物作为固定相的一部分起保留作用，随着污染程度的逐步增加，保留时间发生趋向性的变化。 流动相组成变化: 如甲醇等挥发引起保留时间逐步变大。 相塌陷：纯水条件下，C18柱会发生固定相塌陷，引起保留时间逐步变小甚至失去保留能力。3.柱与柱之间的重现性 同一批填料生产出的不同柱子，装柱密度或柱体积的不同引起保留时间不一致。同样尺寸规格柱子，填料装得越结实，柱体积越小，保留时间越快。正常情况只有百分之几的差别。 平衡程度、老化程度、使用历史及污染程

　　64、度的不一样都会导致两根同品牌同批次色谱柱之间的保留时间不一致。4.批与批之间的重现性 由于不同批次填料之间的差异性导致。主要是表面键合度（可用载碳量指标）和羟基活性方面的差异。可调整方法提高方法的适应性，或者让厂商备存足够的同批次的适应方法的填料。 色谱柱如果得到正确使用、维护和保养，寿命会很长。在使用保护柱的情况下，有寿命超过1万针的实例。如果不用保护柱，即便得到很好保养维护，一般能用到2000针左右就不错了。不过保护柱频繁换柱芯的成本也不低，而且使用装填不好的保护柱还会影响分离质量。 

　　65、; 对硅胶基质色谱柱，流动相p H值和样品清洁程度对寿命影响较大。个人认为高柱温对寿命有影响，但不大，即使方法要求70摄氏的柱温，也没发现有显著的寿命缩短。进针前样品处理得越干净，色谱柱寿命当然越长。但样品前处理也是需要花钱的，需要在前处理成本、色谱柱成本和数据质量之间进行权衡。 色谱柱是高档仪器中的高档部件，表面看，一支只有和筷子一样大小的色谱柱，2000-5000元价格算比较昂贵了，但色谱柱的使用成本占整个分析成本的比例却很低。 因为色谱柱是耗材中可重复试用次数算多的，按平均用2000次计算，单次使用成本仅有1-2元人民币，与制样和试剂成本相比，几乎

　　66、可忽略不计。制样用的SPE萃取小柱，过滤样品和流动相的滤膜，一次性用完之后，我们眼都不眨就扔掉了。因此，尽管通过本文中提到的很多再生清洗方法能延长使用寿命，但还需要权衡是否值得花时间这样做，一是清洗色谱柱用的试剂是需要成本的，二是再生修复的柱子毕竟不能完全恢复到新柱的性能，三是继续使用性能已经下降很多的色谱柱，万一造成分析项目失败，得不偿失。 建议每支色谱柱固定做一种分析方法。尽管一开始需要备的色谱柱多一些，但从长期来看，这样做和用一根色谱柱来回切换用于不同的样品分析相比，产生问题会更少，色谱柱花费的总体成本会更低。六、其它疑难的色谱技术问题（问题集锦）&#

　　67、160;对一些经常问到的、具有普遍性的问题和实例进行剖析讲解，欢迎大家提问。1、网上对柱子是否可以反冲一直有争论，那什么样的柱子可以反冲，什么不可以。反冲后是正者用，还是反着用。具体到各型号柱子不仅是ODS柱，其他如正向柱、氨基柱、离子交换柱等最好都有解释。2、您那阿莫西林胶囊的测定的什么样品啊？咋就一个峰呢？标样？3、对于一根常用的c18柱，拿到一根新柱的时候应该怎样进行活化及维护？为什么要这样做？4、测定多肽，一般采用什么柱子？流动相是乙腈和水，还有微量的TFA。特别是像类似三肽的短肽，应该怎么选择柱子？5、氨基柱在进酸性样品时，很伤柱子，如使用一段时间后，柱效降低

　　68、，峰形改变，如何恢复？6、色谱柱的技术都有哪些？比如封尾等，这些技术在应用时都体现在哪里？7、色谱柱技术的差距在哪里？8、柱子在什么情况下可以清洗一下筛板呢？原来也讨论过这个问题，我也拆下来清洗过，但我看到柱前段的污染更甚，于是就用刀片刮了刮，然后把清洗好的筛板安装上去。问题解决了，但使用寿命会不会减少呢？9、如果柱子取下来放置一段时间，需要做什么保护吗？10、流动相中加入适量的四氢呋喃可以改善峰形的机理是什么？11、关于色谱柱的填装问题！我个人认为现在色谱柱的填装一般有3种情况：1.国外生产填料并填装完成成品卖到国内；2.国外生产填料，国内填装销售；3.国内生产填料，国内填装销售。一般情况下，第1种情况卖的最贵，也质量最好！可是我就不明白了：如果是填料的生产很复杂的话，那么填装上国内也跟不上去吗？为什么换在国内填装就会出现或多或少的一些小问题呢？12、国产色谱柱在市场上占有比例如何啊？13、预柱或保护柱用还是不用的问题！原来分析中药品种时，我一直都是用保护柱。但来到新公司后，发现大家都没有使用，几个实验室连保护柱都没找到一个，也就是说大家从来都没有用过。后来问一个老员工，说是有可能影响药品分析。我就想问：安装保护柱后会影响样品分析吗？我们做的大多是头孢类的抗生素。14、用的是四元梯度泵 A50%甲

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　　（衡水万卷）高三化学二轮复习 周测卷 化学常识（含解析）-人教版高三化学试题