我国水产用中草药制剂占《国标渔药》中很大的比例，一些水产用中草药制剂包装袋上虽然写着有抑菌、杀虫的功效，以及治疗水产养殖动物的细菌、寄生虫病等多种疾病。但是，在水产养殖实践中的大量的应用结果却是不尽人意的。少数企业为了实现包装袋上的所说的“疗效”，而在其制剂中违规地添加一些西药等，导致发生更严重的质量安全事件，也已经是累见不鲜的问题了。

　　这篇小文章陈述了在研制水产用中草药制剂时，经常采用一些抑菌效果评价方法中的问题。旨在引起相关研究人员的注意，希望能根据水产用中草药制剂的特点，采用更为科学的评价方法，在充分发挥中草药中多糖类物质含量多的长处的基础上，研究与开发出具有中国特色的水产用中草药制剂。

　　摘要：本文在简要地叙述水产用中草药制剂抑菌效果实验方法的基础上，指出根据抑菌效果评价水产用中草药的功效，对指导水产用中草药制剂研究与开发存在局限性。建议根据中草药中含有大量多糖类物质的特点，改变对水产用中草药功效的实验方案，调整水产用中草药制剂功效的评价指标，将对水产养殖动物免疫系统的免疫防御功能的调节作用，作为评价水产用中草药功效的指标。将中草药制剂作为预防水产养殖动物疾病的药物，是我国研究与开发水产用中草药制剂的方向。

　　近些年来，由于抗微生物药物的不科学的滥用，导致耐药性菌株不断地增加，致病性细菌及真菌的耐药性增强，致使各种传染性疾病导致的病死率不断增高。国内外医学界一直在致力于寻找有效、安全的新型的抗微生物药物。

　　近千年以来，具有清热、解毒功效的中草药，在我国人类与养殖动物传染性疾病防控中发挥了重要作用。因为在中草药中存在很多活性强、毒性低的有效成分。因此，从天然产物中寻找抗微生物药物的资源，筛选抗微生物药物越来越受到国内、外学者的重视。通过体外抑菌实验，筛选具有抗微生物活性的中草药有效成分，一直是研究者关注和不断改进的研究方法。

　　本文将中草药抑菌实验中，检测中草药制剂最小抑菌浓度（MIC）的试验方法，进行简要介绍的基础上，提出了采用这些评价方法检测水产用中草药功效时的问题，提出了研究与开发水产用中草药制剂的评价方法。

　　纸片扩散法的全称为抗微生物药物纸片琼脂扩散法敏感试验（简称改良K-B法)。是上世纪70年代，由世界卫生组织（WHO）在日内瓦召开的国际性会议上，通过并向全世界推荐的方法。

　　其基本原理是，将含有定量抗微生物药物的纸片，贴在已接种测试细菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分，溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内的供试细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映供试细菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。这种实验方法的特点是精确度没有琼脂稀释法高，但是可以在同一平皿上观察一种细菌对多种中草药成分的敏感度或耐药性，结果很直观，易于判断、比较。

　　稀释法是定量测定抗微生物药物抑制细菌生长作用的体外方法，主要测定细菌对某药的MIC，该方法又常常分为琼脂稀释法和肉汤稀释法。

　　琼脂稀释法是将不同浓度抗微生物中草药药物成分分别混匀于琼脂培养基中，配制出含各种浓度药物的平板，使用微量多头接种仪接种细菌，孵育后观察细菌在含不同浓度药物平板上的生长情况，以抑制细菌生长的平板所含的药物浓度测得MIC。该法的特点是可同时做多株细菌的MIC测定，结果及重复性优于肉汤稀释法，且易于发现耐药突变株或污染，是验证新药体外抗微生物活性时常用的参照标准。琼脂稀释法能够准确得到MIC，观察某一浓度药物对多株细菌的作用效果，如果做科研，其是一种比较简便、经济的方法，可信度也较高。缺点是制备含药琼脂平板较费时费力。

　　美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）推荐使用肉汤培养基即Mueller Hinton（MH）肉汤，pH 7.2~7.4。需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中均生长良好。肉汤稀释法分为常量稀释法（macrodilution）和微量稀释法（microdilution），前者使用无菌试管，每一浓度抗微生物药物的量通常为2.0mL；后者使用微量稀释孔，每孔有0.1mL肉汤。其原理是用MH肉汤将抗微生物药物做不同浓度的稀释后，再接种待测菌，定量测定抗微生物药物抑制待测细菌的最小抑菌浓度。一般抗微生物药物原液浓度应该为最高测试浓度的10倍，原液应贮存于-60℃条件下，且存放时间不宜超过6个月。微量稀释法时常采用比浊仪判断是否有细菌生长。

　　传统药敏试验方法的优点是重复性好、结果比较准确。然而，临床实践证明这些方法存在耗时长、操作繁琐、判读结果时容易受主观因素影响等诸多不足。VITEK、Autobac-MTS、MS-2系统等仪器检测虽快速，但时，通过透过光量与菌液浓度成反比的浊度方法来判定药物对细菌的MIC，接种菌量及作用终点的判断问题难以解决。由于FCM的特点，可对细胞进行逐个检测，能更快速、更准确、多参数检测微生物药敏试验，可大幅度地缩短检测时间。

　　这种方法的主要依据是利用药物作用于真菌细胞壁和细胞膜后，渗透性发生改变，内部的DNA物质与外源加入的可与DNA结合的荧光染液溴化乙锭及碘化物（PI）等结合，呈现红色荧光反应。再利用增强的红色荧光强度和降低的前向角光散射，以及阴性阀门技术测定药物敏感性。

　　利用FCM检测结核分枝杆菌的药物敏感性的原理:分枝杆菌内的非特异性酯酶能水解荧光素二聚体（FDA）为游离的荧光素，游离荧光素在菌体内堆积很容易通过FCM检测到，当细菌被杀灭或被药物抑制时其分解FDA的能力显著降低，产生的游离荧光素也明显减少。因此，可根据FDA产生游离荧光素的多少利用FCM来检测结核杆菌的耐药性。

　　E实验是一种新型的检测细菌或真菌对抗微生物药物敏感性的方法。这种方法是结合了稀释法和扩散法的原理和特点，测定细菌对抗微生物药物的敏感度的定量技术。该实验综合了扩散法和稀释法各自的优点，操作简便同扩散法，又可以象稀释法一样直接定量测出抗微生物药物对测试菌的MIC，结果准确，重复性好。但是，价格比较昂贵。

　　E-test试条为一5.0mm~50.0mm非活性的塑料薄条，背面固定有一系列预先制备的干燥而稳定的连续指数浓度梯度的抗微生物药物，正面标有相应的抗微生物药物浓度刻度。当E-test试条被放至一个已接种细菌的琼脂平板时，其载体上的药物立即且有效地释放入琼脂介质，从而在试条下方即刻建立一个抗微生物药物浓度的连续的指数梯度。经过孵育后，即可见一个以试条为中心的对称抑菌椭圆环。椭圆环边缘与试条的交界处的刻度，即为相应的MIC值。

　　全自动药敏仪是专业设计用于微生物实验室进行快速细菌鉴定及药物敏感试验的全自动设备。仪器自动化程度高，工作流程简便，维护简单，主要应用于大型医院的临床检测。

　　上述内容中介绍的常用的中草药制剂抑菌实验方法，可以看出每种实验方法都具有各自的特点。随着人们不断地探索研究新技术，今后可能还有一些新的实验方法取代传统的方法。也可以根据不同的实验条件、目的和要求选择不同的中草药制剂抑菌实验方法，以期获得更准确的实验结果，为开发水产用中草药制剂的筛选提供可靠的实验依据。

　　但是，如果用上述实验方法检测与评价中草药制剂的抑菌效果，无论是对中草药制剂采用的煎煮法，还是有机溶剂萃取法获得的中草药制剂中的有效成分作为供试药液，测定的对致病性细菌的MIC，如果换算成水产用中草药制剂对患病水产养殖动物的用药剂量，并且让中草药制剂在患病水产养殖动物体内病灶部位达到MIC的药物浓度，其实际用药量将会是很大的，其生产成本将是难以承受的。如果不是直接采用中草药制剂中的有效成分，也是难以做到的。而从水产用中草药制剂中提取有效成分，其用药成本也往往是水产养殖业者难以接受的。

　　因此，上述实验方法虽然是可以用于水产用中草药制剂抑菌效果的检测。但是，采用检测到的抑菌实验结果，是难以用于指导研发水产用中草药制剂，对患病水产养殖动物疾病治疗的。而几十年来在水产养殖业中使用水产用中草药制剂的实践结果证明，以抑菌效果为指标的水产用中草药制剂，是不可能用抑菌效果作为指标评价其产品的质量的。

　　中草药的药用功能是与有效成分有密切关系的。一般而言，虽然的确是有一部分中草药中含有的有效成分，具有抑菌或者杀虫的功能。但是，可能这种成分的含量是比较少的。在将其用于治疗患病水产养殖动物疾病时，如果所使用的剂量无法在患病水产养殖动物体内达到一定的药物浓度，就可能不会有抑菌和杀虫的功效。而将其作为水产用兽药治疗患病水产养殖动物的疾病，是必须要达到一定的用药量的。因此，将水产用中草药制剂作为抑菌、杀虫用的水产用兽药，用于治疗水产养殖动物的细菌或者寄生虫病，在客观上是存在一定困难的。

　　现代中草药化学研究结果表明，中草药中存在对动物免疫系统具有调节作用的多糖类物质是很多的，如黄芪多糖、人参多糖、刺五加多糖、牛膝多糖等。此外，在苷类化合物中，黄芪苷、白芍总苷、淫羊藿苷、雷公藤苷、大豆皂苷等，研究结果均已经证实，这些物质是具有很强的免疫调节作用的。生物碱类化合物中，如苦参碱、奎宁、棘豆生物总碱等。除了上述三种化学成分以外，中草药还含有其它的一些有效成分，如挥发油类、黄酮类化合物、醌类化合物、萜类等，这些物质也具有增强机体免疫功能的作用。这些成分均以有机复合物形态存在，除单个成分所起的作用，还有各成分间的复合作用。

　　因此，改变水产用中草药制剂功效的实验方案，调整水产用中草药制剂的评价指标，将对水产养殖动物免疫系统的免疫防御功能的调节作用，作为评价水产用中草药制剂功效的指标，充分发挥中草药制剂在水产养殖动物疾病预防中的作用，是我国研究与开发水产用中草药制剂的方向。