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苯酚法提取演示文稿ppt
时间:2023-12-29 20:51 点击次数:146

  细胞内大部分RNA 均与蛋白质结合在一起,以核蛋白的形式存在。因此,提取RNA时要把RNA与蛋白质分离并除去。将细胞置于含有十二苯酚法提取演示文稿

  细胞内大部分RNA 均与蛋白质结合在一起,以核蛋白的形式存在。因此,提取RNA时要把RNA与蛋白质分离并除去。将细胞置于含有十二烷基磺酸钠(SDS)的缓冲液中,加等体积水饱和酚,通过剧烈振荡,然后离心形成上层水相和下层酚相。核酸溶于水相,被苯酚变性的蛋白质或者溶于酚相,或者在两相界面处形成凝胶层。

  缓冲液系统可使大部分RNA-蛋白复合物解离,而DNA-蛋白复合物只有极少部分解离;用酚处理时DNA-蛋白复合物变性,在低温条件下从水相中除去,这样得到的RNA 制品中混杂的DNA 极少。用***仿-异戊醇继续处理RNA 制品,可进一步除去其中少量的蛋白质。最后用乙醇使RNA 从水溶液中沉淀出来。本法得到的RNA 不仅纯度高,而且多呈自然状态,可供继续研究之用。

  称量干燥的Eppendorf管的质量,取活性干酵母在研钵中研碎,取1g加入Eppendorf管,加10mL SDS-缓冲液使成匀浆。再加溶菌酶1mL,混匀,室温静置10min,再加10ml饱和酚液,室温下剧烈振荡5min,置冰浴中分层。

  在0~4℃低温环境下,10 000r/min 离心10min。吸出上层清液,转入新的Eppendorf 管。

  加同上清液等体积***仿-异戊醇,,然后10 000r/min 离心5min。吸出上层清液,转入另一新Eppendorf 管。

  加2 倍体积95%乙醇(含2%乙酸钾),在冰浴中放置30min,使RNA 沉淀。再以10 000r/min 离心5min,弃上清液,

  沉淀用少许无水乙醇洗一次,迅速离心各1min,保留沉淀。倾去***后,减压真空干燥,准确称重,记录。

  将干燥后RNA产品配制成浓度为10—50μg/ml的溶液,在紫外可见分光光度计上测定其260nm处的吸光度,按下式计算RNA制品纯度及RNA 提取率

  2、使用离心机时,对称的两只Eppendorf管的质量一定要相同,以保证重心在轴心上。

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