1.本发明涉及用高效液相色谱-质谱联用仪直接测定出厄贝沙坦中5-(甲基(亚硝基)氨基)-戊酸(以下简称nmba)的含量。此方法能较好的控制厄贝沙坦痕量nmba含量，为患者的健康安全用药提供保障，属于医药技术领域。

　　2.厄贝沙坦，化学名2-丁基-3-[4-[2-(1h-四唑-5-基)苯基]苄基]-1，3-二氮杂螺-[4,4]壬-1-烯-4-酮。

　　厄贝沙坦是一种治疗原发性高血压，合并高血压的2型糖尿病肾病的药物。在厄贝沙坦工艺中，残留溶剂n-甲基吡咯烷酮(以下简称nmp)与亚硝酸盐可能形成杂质nmba。根据ich m7指导原则，nmba归为第一类基因毒性物质，td50＝0.982mg/kg/day。转换成pde为0.98μg/day，基于厄贝沙坦的日剂量300mg/day，计算出nmba限度值为3.2ppm。然而，根据美国fda的最新要求，厄贝沙坦中nmba杂质含量被特定地降低10倍至0.32ppm。nmba结构如下：

　　准确定量地测定厄贝沙坦中痕量的nmba含量极具挑战性。很难采用气相、液相色谱等对其进行痕量直接测定。

　　目前，测定厄贝沙坦中nmba含量的方法只有采用经典的色谱法,其专一性、灵敏度、方法精密度和重复性都存在很大的缺陷，不能提供可靠的痕量分析结果。为了克服原方法的缺陷，本发明采用高效液相色谱-质谱联用仪直接测定厄贝沙坦中nmba的含量。该分析方法具有操作简单、专一性好、灵敏极高、重现性好等特点。

　　如上所述，直接准确定量测定痕量nmba存在各种缺陷。最直接提高灵敏度的手段为增大进样体积和/或增加api浓度。但是，厄贝沙坦仅能溶解在非极性溶剂中，而nmba极性大，在反相柱上保留必须用高比例水相流动相，因为稀释剂和流动相存在较大的极性差异，增大进样体积易造成了显著的“强溶剂效应”使峰展宽裂分，反而降低了灵敏度。另外，己有方法中厄贝沙坦的浓度已接近上限，无再增加的空间。为了在原hplc-ms方法基础上，增加对nmba的检测灵敏度，我们利用厄贝沙坦高脂溶性，以及nmba在碱性水溶液中高溶解性的理化特征，增加了样品预处理技术环节。先将厄贝沙坦以较高的浓度溶解于非极性溶剂，例如乙酸乙酯，二氯甲烷等，再用较少量的碱性水溶液将nmba以羧酸负离子状态萃取至水相，该过程中，在水相中能高效地富集厄贝沙坦中的nmba，而水相中几乎不含厄贝沙坦。另外，由于样品稀释剂为纯水相，与高比例水相流动相不会产生“强溶剂效应”，还可以增大进样体积而不会发生峰展宽与裂分现象。样品富集预处理结合增大进样量可极大的提高了方法的灵敏性。

　　通过试验发现厄贝沙坦在乙酸乙酯，二氯甲烷等非极性溶剂中有非常好的溶解性。本发明将用乙酸乙酯，二氯甲烷等非极性溶剂作为样品的稀释剂。

　　本发明涉及一种厄贝沙坦中nmba含量的测定分析方法，该方法为直接用高效液相色谱-质谱联用仪测定厄贝沙坦中nmba的含量。

　　上述样品配制中用乙酸乙酯，二氯甲烷等非极性溶剂将样品溶解，选用碳酸氢钠溶液萃取。

　　(1)取厄贝沙坦粉末或制剂粉末，以乙酸乙酯，二氯甲烷等非极性溶剂作为稀释液溶解样品，加入碳酸氢钠萃取。

　　(2)采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为0.02％-0.5％七氟丁酸水溶液和乙腈，进行梯度洗脱。

　　(3)梯度为0-10min，流动相b比例为5％-12％，7-15min，流动相b比例为95％。

　　(4)设置流动相流速为0.3-1.5ml/min，柱温控制在25℃-50℃之间。

　　(6)采用质谱检测器，离子模式选择正离子，取(1)的萃取后的水层清液进样，记录nmba质谱离子流图。

　　样品溶液：精密称取100.0mg样品于20ml的顶空瓶中，加入约15ml的乙酸乙酯，二氯甲烷等非极性溶剂溶解完全后，精确加入2.0ml的碳酸氢钠溶液进行萃取，进样。

　　本发明使用色谱柱为：十八烷基硅烷键合硅胶填料。流速：0.3-1.5ml/min。柱温：25℃-50℃。流动相a：0.02％-0.5％七氟丁酸水溶液；流动相b：乙腈。

　　时间流动相a流动相b0min92％8％6.5min92％8％6.6min5％95％13.0min5％95％13.1min92％8％23.0min92％8％

　　附图4：根据本发明实施例3得到的厄贝沙坦样品加样回收率质谱总离子流图。

　　为了更好的理解本发明的技术方案，下面结合本发明的具体实施例作进一步说明，但其不限制于本发明。

　　时间流动相a流动相b0min92％8％6.5min92％8％6.6min5％95％13.0min5％95％13.1min92％8％23.0min92％8％

　　1)稀释液：1-100mm碳酸氢钠水溶液(称取适量的碳酸氢钠，精密称定于容量瓶中，先加入超纯水定容，超声溶解。)

　　2)萃取空白溶液：移取15ml的乙酸乙酯，二氯甲烷等非极性溶剂于25ml的顶空瓶，再精密移取2.0ml的稀释液，拧紧盖子，剧烈振摇萃取3分钟，静置待分层，移取水相作为萃取空白溶液。

　　3)标准储备溶液：称取30.0mg nmba标准品，精密称定于10ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释到刻度，混匀；准确移取100μl到10ml容量瓶中，用乙酸乙酯，二氯甲烷等非极性溶剂稀释到刻度，混匀；准确移取100μl到10ml容量瓶中，用乙酸乙酯，二氯甲烷等非极性溶剂稀释到刻度，混匀。(nmba浓度：300.0ng/ml)

　　4)标准溶液：准确移取100μl标准储备溶液到25ml顶空瓶中，加入约15ml的乙酸乙酯，二氯甲烷等非极性溶剂，精密移取2.0ml的标准溶液，拧紧盖子，剧烈振摇萃取3分钟，静置待分层，取水相待进样。(nmba浓度：15.0ng/ml)。记录质谱棒图，见典型图1。记录nmba质谱总离子流图，见典型图2。

　　时间流动相a流动相b0min92％8％6.5min92％8％6.6min5％95％13.0min5％95％13.1min92％8％23.0min92％8％

　　1)稀释液：1-100mm碳酸氢钠水溶液(称取适量的碳酸氢钠，精密称定于容量瓶中，先加入超纯水定容，超声溶解。)

　　2)萃取空白溶液：移取15ml的乙酸乙酯，二氯甲烷等非极性溶剂于25ml的顶空瓶，

　　再精密移取2.0ml的稀释液，拧紧盖子，剧烈振摇萃取3分钟，静置待分层，移取水相作为萃取空白溶液。

　　3)供试品溶液：称取100.0mg厄贝沙坦供试品，精密称定于25ml顶空瓶，加入15ml乙酸乙酯，二氯甲烷等非极性溶剂超声溶解，精密移取2.0ml的稀释液，拧紧盖子，剧烈振摇萃取3分钟，静置待分层，取水相即为供试品溶液。(供试品浓度：50.0mg/ml)记录nmba质谱总离子流图，见典型图3。

　　时间流动相a流动相b0min92％8％6.5min92％8％6.6min5％95％13.0min5％95％13.1min92％8％23.0min92％8％

　　1)稀释液：1-100mm碳酸氢钠水溶液(称取适量的碳酸氢钠，精密称定于容量瓶中，先加入超纯水定容，超声溶解。)

　　2)萃取空白溶液：移取15ml的乙酸乙酯，二氯甲烷等非极性溶剂于25ml的顶空瓶，再精密移取2.0ml的稀释液，拧紧盖子，剧烈振摇萃取3分钟，静置待分层，移取水相作为萃取空白溶液。

　　3)回收率溶液：称取100mg厄贝沙坦供试品，精密称定于25ml顶空瓶，准确加入100μl标准储备溶液，加入约15ml乙酸乙酯，二氯甲烷等非极性溶剂超声溶解，精密移取2.0ml的稀释液，拧紧盖子，剧烈振摇萃取3分钟，静置待分层，取水相即为回收率溶液。(供试品浓度：50.0mg/ml；nmba浓度：15.0ng/ml)记录nmba质谱总离子流图，见典型图4。