枣（ Ziziphus jujuba Mill）是一种多刺的鼠李科植物，原产于中国，广泛分布于北半球温带和亚热带地区，尤其是中国北方的干旱地区。几千年来，它也被用作传统中药，对人体健康有许多有益的作用。此外，大枣还具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、增强免疫等多种保健功能。环磷酸腺苷（cAMP）是枣中最重要的功能成分之一，成熟枣中cAMP的含量为30～160 μg/g，是180多种天然植物中观察到的最高值。它作为第二信使，通过释放酶、激素等物质，具有维持免疫系统平衡和控制疾病的潜在作用。cAMP是一种参与调节细胞内物质代谢等生物学功能的核苷酸衍生物，广泛分布于各种植物中，具有抗炎、抗肿瘤和保护免疫系统等多种生物活性。

　　从枣中提取cAMP的传统技术包括溶剂萃取（SE）、回流萃取（RE）、热萃取（HE）和微波辅助萃取（MAE）。这些提取方法通常耗时费力、选择性低、提取率低。酶辅助提取是一种温和、高效、环保的提取方法，其中果胶酶通过分解增加溶剂对植物细胞壁的渗透在各种资源中提取生物活性材料。超声波的机械效应则引起的空化现象增加了溶剂对植物细胞的渗透性，从而提高了提取效率。超声波辅助果胶酶提取(UAPE)结合了这两种方法，迄今为止，该技术已被用于从诸如橙、芹菜等处理废物的植物中提取提取物，尽管UAPE已广泛应用，但关于UAPE作用于cAMP的研究尚且很少。

　　大鼠嗜碱性白血病（RBL-2H3）细胞系是大鼠嗜碱性白血病的一个亚系，表达肥大细胞的许多特征和功能。肥大细胞是过敏性疾病的主要效应细胞，在即发性过敏反应和迟发性反应中均发挥重要作用。因此，RBL-2H3细胞通常被用作肥大细胞系过敏反应的替代模型。利用RBL-2H3细胞基于此原理构建细胞过敏Ⅰ型模型，对cAMP作用于过敏的效用进行研究，探讨其作用机理。cAMP通过抑制 β-hex释放和阻断细胞内Ca 2+内流的产生，降低脱粒水平和调节细胞因子释放细胞因子的分泌，虽然cAMP对蛋白质磷酸化的抑制作用和相关基因的表达尚未确定。但通过枣中cAMP的提取物以及cAMP本身与lgE介导的RBL-2H3细胞过敏模型间的相互作用，进一步验证了从枣中提取的cAMP在调节过敏反应中抗过敏和调节免疫功能的有益作用。枣中cAMP的作为一种潜在的缓解I型过敏的食品成分，其抗过敏作用机理有待进一步研究。

　　采用超声波辅助果胶酶法提取红枣中的cAMP，分别以料液比、果胶酶添加量、水浴温度、超声时间4个主要因子进行单因素试验，分析不同处理条件对红枣cAMP提取的影响。通过单因素实验确定UAPE获得cAMP最高提取率的最佳条件如图2，分别为：果胶酶与原料之间料液比为5 mL/g，果胶酶含量为1.0%、提取温度40 ℃和提取时间固定60 min。超声波辅助果胶酶法提取红枣中的cAMP，在单因素试验结果的基础上，正交试验分析料液比、果胶酶添加量、水浴温度、超声时间对红枣cAMP提取量的影响，结果见表1。由极差分析R A＞R B＞R D＞R C可知，四种因素对红枣cAMP提取量影响的排序为：A（料液比）＞B（果胶酶添加量）＞D（超声时间）＞C（水浴温度）。方差分析表明，液固比、果胶酶原料比和提取时间对cAMP提取率的贡献显著，提取温度不显著。在此分析的基础上，综合考虑cAMP提取效率、能源成本和实验可行性，确定最佳提取条件如下：A 2B 1D 1C 1（液固比5 mL/g，果胶酶与原料比为1.5%，提取时间60 min，提取温度40 ℃）。验证该条件下cAMP的提取量为783.0 μg/g，为超声波辅助果胶酶法提取红枣cAMP的最大提取量。

　　食物过敏的主要类型，即I型超敏反应，是IgE介导的免疫反应。本研究成功构建了DNP-IgE/DNP-BSA机理诱导的RBL-2H3细胞过敏模型，为评价体外抗过敏作用提供可行性方法。通过MTT法检测cAMP对RBL-2H3细胞增殖的作用结果如图3所示。cAMP浓度在0~100 μg/mL之间对细胞存活率的影响不显著（ P＞0.05）。当cAMP浓度大于300 μg/mL，细胞存活率极显著降低（ P＜0.01）。cAMP作用于RBL-2H3细胞过敏的合适浓度为0~100 μg/mL，且CC 50（细胞系半毒浓度）介于300 μg/mL~600 μg/mL。

　　将终浓度为25 L、50、100 μg/mL的cAMP分别作用于RBL-2H3细胞过敏模型，同时设置空白对照、过敏模型组cAMP 浓度为（0 μg/mL）和阳性对照（富马酸酮替芬50 μg/mL），在倒置显微镜对细胞的脱颗粒形态进行观察，结果如图4所示。空白对照组（图3a）细胞生长状态良好，成纤维状，边缘光滑有光泽，细胞密度高，分布均匀，形态较大且清晰，颜色较浅。过敏模型组（图3b）的细胞内部可以看到颗粒物质，外部皱缩，成颗粒状或椭圆形，颜色较深。与空白对照组比较，过敏模型组出现了明显的脱颗粒作用。过敏治疗药物富马酸酮替芬50μg/mL（图4c）对脱颗粒的缓解作用明显。不同浓度的cAMP（图4d1-d3）对细胞脱颗粒都具有一定的缓解作用，部分细胞肿胀和扭曲变形的程度减弱，周围有部分颗粒物，其中25 μg/mL cAMP的作用较弱，50 μg/mL和100 μg/mL cAMP作用效果较强，但都不及阳性对照组的作用效果。

　　β-氨基己糖苷酶活性是评估细胞过敏的关键性指标，对Ⅰ型超敏反应早期对脱颗粒过程中 β-hex分泌进行观察与测定。刺激致敏后几分钟内因细胞因免疫系统被破坏从而释放细胞颗粒，发现DNP-BSA刺激anti-DNP致敏后的RBL-2H3过敏模型组 β-氨基己糖苷酶活性，与对照组差异显著增加（ P＜0.01）。与对照组相比，试验组中100 μg/mL cAMP对 β-氨基己糖苷酶的释放没有抑制作用（ P＞0.05）。25 μg/mL、50 μg/mL cAMP β-氨基己糖苷酶对活性抑制效果良好（ P＜0.01），阳性对照组达到正常水平。通过测量 β-hex的活性来确定它是否具有抑制肥大细胞活化和脱粒的潜力，脱颗粒反应的缓解说明cAMP在I型超敏反应早期具有抵抗一系列反应发生的作用。对RBL-2H3细胞释放 β-hex的抑制作用表明，cAMP通过抑制 β-hex的释放来抑制嗜碱性粒细胞的脱颗粒，减少细胞内物质的分泌。实验中对 β-hex释放的明显抗性表明cAMP可以作为一种有前途的新型抗炎剂进行开发和利用。

　　收集RBL-2H3细胞的上清，利用ELISA试剂盒测定了细胞释放促炎因子TNF-α和抗炎因子IL-10释放的水平，如图6所示。DNP-BSA刺激致敏后RBL-2H3细胞中两种不同的细胞因子含量与空白对照组相比，明显升高（ P＜0.01）。细胞中的IL-10含量变化如图6a所示，经cAMP作用后抗炎因子IL-10的含量与模型组相比显著升高，促炎细胞因子分泌减少也可能归因于cAMP调节某些蛋白质的磷酸化进程。25 μg/mL和50 μg/mL cAMP作用后IL-10浓度的增加呈cAMP浓度依赖性增加。细胞中的TNF-α含量变化如图6b所示，25和50 μg/mL的cAMP作用后降低了TNF-α的含量，说明cAMP具有抵抗I型超敏反应晚期一系列反应的作用。cAMPA促进抗炎因子IL-10的释放，抑制炎症因子TNF-α释放，可能通过影响AKT活性，调节机体免疫机理。两种细胞因子水平对过敏反应下游效应细胞也有一定的调控作用。

　　细胞内的Ca 2+源于内质网钙库Ca 2+的释放和细胞 Ca 2+ 的内流，在细胞信号转导中发挥“第二信使”的作用。 Ca 2+ 作为众多经典信号通路的交汇点，将细胞接收的胞外信号转换为胞内信号，内流到细胞内的 Ca 2+ 可促进颗粒与膜融合、促进细胞脱颗路，还能通过转录因子和蛋白激酶通路促进细胞因子和炎症介质的产生。细胞内 Ca 2+ 浓度参与人体免疫调控，对机体过敏反应有一定的影响。

　　荧光探针Fluo-3，AM可与钙离子特异性结合，荧光激发发射绿光，可用来判断钙离子浓度的变化。用倒置荧光显微镜观察cAMP作用于RBL-2H3细胞过敏模型后胞内游离钙离子浓度，结果如图7。从图中可以看出空白对照组中 Ca 2+ 浓度较低，过敏模型组荧光点的密度和强度明显增强，钙离子浓度显著增大。在25～100 μg/mL浓度范围cAMP作用，干预剂量依赖性地显著抑制DNP-BSA刺激的致敏RBL-2H3细胞中 Ca 2+ 的细胞内流动，与抑制RBL-2H3释放 β-hex的趋势相同。细胞内 Ca 2+ 浓度增大，通过与CaM结合导致其构象变化，影响脱颗粒有关的 Ca 2+ /CaM信号转导途径，进一步激活蛋白激酶参与囊泡的传送，释放活性物质，与细胞脱颗粒现象密切相关。可以看出cAMP可有效抑制细胞外 Ca 2+ 的摄入，从而抑制RBL-2H3细胞脱颗粒，影响细胞因子水平，调控免疫系统，增强免疫能力。

　　综上所述，本研究成功构建了RBL-2H3细胞过敏模型。采用MTT法确定cAMP作用于RBL-2H3细胞的浓度不应高于100 μg/mL。利用cAMP对致敏细胞进行干预，有效抑制嗜碱性粒细胞脱颗粒的发生，显著降低 β-Hex的活性，其最优作用浓度为50 μg/mL。此外，cAMP通过上调抗炎因子IL-10的水平，下调促炎因子TNF-α的水平，抑制细胞内 Ca 2+ 的内流。cAMP通过抑制β-hex释放和阻断细胞内 Ca 2+ 内流的产生，降低脱粒水平和调节细胞因子释放细胞因子的分泌，对RBL-2H3细胞致敏现象如炎症、 Ca 2+ 流失等有一定的缓解作用，对lgE介导的过敏反应起到了调节作用。虽然cAMP对蛋白质磷酸化的抑制作用和相关基因的表达尚未确定。但通过枣中cAMP的提取物以及cAMP本身与lgE介导的RBL-2H3细胞过敏模型间的相互作用，进一步验证了从枣中提取的cAMP在调节过敏反应中抗过敏和调节免疫功能的有益作用。

　　白乔，女，工程硕士，西北农林科技大学食品科学与工程学院2017级硕士研究生，主要研究方向为食物致敏原与安全控制。

　　龙芳羽，女，西北农林科技大学食品科学与工程学院副教授，博士生导师，中国食品科学技术学会非热加工技术分会理事和国家有机食品认证高级检查员，Journal of Agricultural and Food Chemistry、Food Chemistry、Food & Funtion、Foods、Innovative Food Science and Emerging Technologies、Journal of Dairy Science等10余个期刊审稿人。近年来主要研究方向为食品非热加工、食物致敏原与安全控制、营养与健康调控。主持国家自然科学基金项目，国家重点研发计划子课题，农业农村部政府采购项目，陕西省重点研发计划项目等10余项国家级及省部级课题，发表文章20多篇。

　　Food Science of Animal Products（ISSN: 2958-4124, e-ISSN : 2958-3780）是一本国际同行评议、开放获取的期刊，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心主办，中国食品杂志社《食品科学》编辑团队运营，属于食品科学与技术学科，旨在报道动物源食品领域最新研究成果，涉及肉、水产、乳、蛋、动物内脏、食用昆虫等原料，研究内容包括食物原料品质、加工特性，营养成分、活性物质与人类健康的关系，产品风味及感官特性，加工或烹饪中有害物质的控制，产品保鲜、贮藏与包装，微生物及发酵，非法药物残留及食品安全检测，真实性鉴别，细胞培育肉，法规标准等。

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