四. 反胶束萃取 反胶束(reversed micelle) 表面活性剂——亲水憎油极性基团、亲油憎水非极性基团 表面活性剂（亲水、亲油基）分散于连续有机相中自发形成的纳米尺度的一种聚集体. 反胶束溶液是透明的、热力学稳定的系统。 反胶束萃取的优点： 成本低，溶剂可反复使用 萃取率和反萃取率高 解决蛋白质变性、降解的问题 从完整细胞中提取蛋白质和酶 表面活性剂（阳、阴、非） 将阳离子表面活性剂如CTAB溶于有机溶剂形成反胶束时，与AOT不同，还需加入一定量的助溶剂(助表面活性剂)。这是因为它们在结构上的差异造成的。 临界胶束浓度 CMC (Critical Micelle Concentration ) 胶束形成时所需表面活性剂的最低浓度； 体系特性，与表面活性剂的化学结构、溶剂、温度和压力等因素有关。 反胶束萃取蛋白质的基本原理 改变水相条件（pH、离子种类和强度）使蛋白质由有机相返回水相，实现反萃取过程. 2）蛋白质进入反胶束相的传质三过程 反胶束萃取蛋白质的推动力 位阻效应 许多亲水性物质可以通过溶入反胶束“水池”来达到它们溶于非水溶剂中的目的，但是反胶束“水池”的物理性(大小、形状等）及水中的活度是可以用W。的变化来调节的，并且会影响大分子如蛋白质的增溶或排斥，达到选择性萃取的目的，这就是所谓的位阻效应。 反胶束萃取蛋白质的影响因素 水相pH值对萃取的影响 水相的pH值决定了蛋白质表面电荷的状态、从而对萃取过程造成影响。 对不同相对分子质量的蛋白质，pH值对萃取率的影响有差异性，当蛋白质相对分子质量增加时，只有增大(pH-PI)值的绝对值，相转移才能顺利完成。 对那些尺寸小于“空核”的反胶束中水体积的蛋白质，只要其所携带的净电荷与表面活性剂电性相反，萃取就能发生。 离子强度对萃取率的影响 a.离子强度增大后，反胶束内表面的双电层变薄，减弱了蛋白质与反胶束内表面之间的静电吸引，从而减少蛋白质的溶解度； b.反胶束内表面的双电层变薄后，也减弱了表面活性剂极性基团之间的斥力，使反胶束变小，从而使蛋白质不能进入其中； c.离子强度增加时，增大了离子向反胶束内“水池”的迁移并取代其中蛋白质的倾向，使蛋白质从反胶束内被盐析出来； d.盐与蛋白质或表面活性剂的相互作用，可以改变溶解性能，盐的浓度越高，其影响就越大。 表面活性剂类型的影响 从反胶束萃取蛋白质的机理出发，选用有利于增强蛋白质表面电荷与反胶束内表面电荷间的静电作用和增加反胶束大小的表面活性剂； 还应考虑形成反胶束及使反胶束变大(由于蛋白质的进入)所需的能量的大小、反胶束内表面的电荷密度等因素，这些都会对萃取产生影响。 反胶束体系不足：不能用于分子量较大的蛋白质的萃取，在两相界面上形成不溶性的膜状物等，解决方法：通过在单一表面活性剂中加入具有亲和作用的生物表面活性剂或另一种非离子型表面活性剂的方法来改善萃取性能。 表面活性剂浓度的影响 增大表面活性剂的浓度可增加反胶束的数量，从而增大对蛋白质的溶解能力。但表面活性剂浓度过高时，有可能在溶液中形成比较复杂的聚集体，同时会增加反萃取过程的难度。应选择蛋白质萃取率最大时的表面活性剂浓度为最佳浓度。 离子种类对萃取的影响 阳离子的种类对萃取率的影响主要体现在改变反胶束内表面的电荷密度上。 极性基团的电离程度愈大，反胶束内表面的电荷密度愈大，产生的反胶束也愈大。 影响反胶束结构的其他因素 1.有机溶剂的影响:影响反胶束的大小而影响水增溶的能力，所以可以利用因溶剂作用引起的不同胶束结构实现选择性增溶生物分子的目的 1）分离蛋白质混合物 如三种低分子量蛋白质的混合物： 细胞色素C，核糖核酸酶a，溶菌酶， 3） 从发酵液提取胞外酶 用AOT/异辛烷反胶束溶液，从芽孢杆菌的全发酵液提取核纯化碱性蛋白酶，酶回收率为50％. 4） 直接提取胞内酶 5）反胶束萃取用于蛋白质复性 Masafumi Sakono等（2004）利用非离子型表面活性剂四甘醇十二烷基醚形成反胶束使碳酸酐酶Ｂ复性，20h内收率达到70%以上。 整体柱固相微萃取 柱管内原位合成的连续床固定相，常为毛细管柱 正相、反相、离子交换、亲和、分子印迹等各种功能 在线富集和分离技术 概述 4.1 反胶束溶液形成的条件和特性 4.2 反胶束萃取蛋白质的基本原理 4.3 影响反胶束萃取蛋白质的主要因素 4.4 应用 传统溶剂萃取技术缺点: 蛋白质40－50℃变性。 蛋白质不溶于有机溶剂，并使蛋白质变性。 蛋白质带有许多电荷，普通萃取剂难奏效。 1977年Luisi等人提出反胶团萃取蛋白质 是构成反胶团的必要条件 概念 表面活性剂 具有工业开发前景的蛋白质分离技术 离子型表面活性剂所形成的反胶束的表面带有电荷： 负电荷（AOT-----丁二酸－2－乙基己基酯磺酸钠) 正电荷 TOMAC(triomethyl-ammonium chloride) 氯化三辛基甲铵 DDAB(didodecyldimethyl ammonium bromide) 溴化十二烷基二甲铵 CTAB(cetyl-methyl-ammonium bromide） 溴化十六烷基三甲胺 AOT 特点：容易获得，具有双链，极性基团较小、形成反胶束时不需加助表面活性剂，并且所形成的反胶束较大，半径为170nm，有利于大分子蛋白质进入。 CTAB DDAB TOMAC 反胶束形成过程 表面活性剂分子自聚集 表面活性剂（临界胶束浓度） 加入 水 有机溶剂 正常胶束 反胶束 非极性核心 溶解非极性物质 极性核心 蛋白质水池 蛋白质保持天然构型 水池 胶束和反胶束结构示意图 反胶团的溶解作用 反胶团内存在微水池，可溶解氨基酸、肽和蛋白质等生物分子，为生物分子提供易于生存的亲水微环境。 四种模型 : (a)水壳模型，蛋白质位于水池的中心，周围存在的水层将其与反胶团壁(表面活性剂)隔开； (b)蛋白质分子表面存在强烈疏水区域，该疏水区域直接与有机相接触； (c)蛋白质吸附于反胶团内壁； (d)蛋白质的疏水区与几个反胶团的表面活性剂疏水尾发生相互作用，被几个小反胶团所“溶解”。 b c d a 三元相图 由水、表面活性剂和非极性有机溶剂构成的三元系统. 能用于蛋白质分离的仅是位于底部的两相区：水相；反胶束溶液。 物理化学性质: 界面张力在0.1－2mN/m，密度差为10％-20％， 反胶束溶液粘度适中，大约为1mPa·s。 蛋白质的萃取 1)蛋白质溶解原理 蛋白质进入反胶束溶液是一协同过程 蛋白质 界面间的表面活性剂 静电作用 变形 包含有蛋白质的反胶束 扩散进入有机相 蛋白质萃取 （相界面） 反萃取过程 萃取 过程 蛋白质（水相） 表面液膜扩散 到达相界面 进入反胶束 含有蛋白质的反胶束 扩散 有机相 蛋白质带正电 荷或负电荷 表面活性剂 发生静电作用 蛋白质在反胶 团中溶解 水相pH ， 蛋白质pI 当蛋白质与表面活性剂电荷相反时，易溶于反胶束，分配系数较大。否则，蛋白质不溶于反胶团 在两相间的分配系数 水相pH值 离子强度 表面活性剂类型、浓度 离子种类 其他因素 离子对表面电荷的屏蔽作用所决定 2.助表面活性剂的影响:当使用阳离子表面活性剂时，引入助表面活性剂，能够增进有机相的溶解容量，这多半是由于胶束尺寸增加而产生的。 3.温度的影响:温度的变化对反胶束系统中的物理化学性质有激烈的影响，增加温度能够增加蛋白质在有机相的溶解度 传统硅胶键合反相吸附剂 (如C18) 高分子聚合物吸附剂(如PLS) 通用性 极性化合物保留较差 极性和弱极性化合物均可保留 稳定性 柱床容易干涸 具有水可润湿性柱床不容易干涸 pH值适用范围 2-7.5 0-14 吸附容量 小 保留化合物多，容量大 高分子聚合物吸附剂与传统硅胶键合反相吸附剂比较 纺织品偶氮检测 ProElut AZO 茶叶农残检测 ProElut TPC 苯并芘检测 ProElut BaP 乳品中农残、氯霉素检测 ProElut DPC ...... 专用柱 其他类型的吸附剂 ProElut Carb (石墨化碳黑) ProElut Alumina N (中性氧化铝) ProElut Alumina A (酸性氧化铝) ProElut Alumina B (碱性氧化铝) 3.3.4 固相萃取方法的建立 1.吸附剂类型选择 2.通用操作方法 3.方法优化与验证 SPE柱的填充 筛板 筛板 筛板 手工SPE操作 固相萃取基本操作步骤 活化 载样 洗涤 洗脱 全自动固相萃取仪 1）根据目标化合物的性质选择 1.吸附剂类型选择 2）根据基质的性质选择 3）其它选择原则 当某一种或一类化合物可以被一种以上的SPE填料从基质中萃取出来时，选择性较好的SPE柱应被选择 选择性：离子交换 正相 反相 固相萃取部分与分析部分的分离机理不同时，最终的分析效果往往较好 4）SPE柱规格选择 1）反相固相萃取柱操作方法 操作流程： 活化：首先用甲醇活化，然后用水或样品溶剂平衡 上样：将溶有目标化合物的样品溶液加入小柱 淋洗：纯水或含适量甲醇的水溶液，或样品溶剂 洗脱：含适量甲醇的水溶液、甲醇或极性更低的有机溶剂 2.标准操作方法 2）正相固相萃取柱操作方法 操作流程： 活化:正己烷或样品溶剂活化/ 平衡 上样:将溶有目标化合物的样品溶液加入小柱 淋洗:正己烷、含适量甲基叔丁基醚的正己烷溶液或样品溶剂 淋洗 洗脱:含适量甲基叔丁基醚的正己烷溶液、甲基叔丁基醚或 极性更强的有机溶剂 3)离子交换固相萃取柱操作 操作流程： 活化：甲醇-水 上样：溶有目标化合物（酸碱离子化）的样品溶液加入小柱 淋洗：依次用水和甲醇淋洗 洗脱：阳离子交换-氨水甲醇、阴离子交换-甲酸甲醇 用标准溶液检验吸附剂对目标物的保留以及洗脱液对目标物的洗脱情况 不满意 重新选择SPE，淋洗液或洗脱液 满意 不添加基质，添加标准溶液考察提取效率 不满意 重新选择提取方式或提取溶剂 在基质中添加标准溶液，经提取，SPE净化，考察回收率大小、是否存在干扰物 不满意 重新选择淋洗液、洗脱液或改进分析方法 满意 确定方法 满意 3.方法优化与验证 氯霉素在ProElut PLS 上的淋洗曲线 方法验证 添加回收率（80%~120%） 相对标准偏差（n＞6，RSD＜10%） 净化效果（有无和目标物重叠或接近的干扰物） 3.3.5 SPE常见问题及解决方法 固相萃取过程中 常见问题 回收率低 SPE柱流速降低或阻塞 重现性差 A 目标化合物在吸附剂上的保留不足：超过5% 的目标化合物出现在样品流出液或淋洗液 可能原因 改进办法 SPE柱选择不合适 选择对目标物有明显 较强保留的SPE柱 样品溶剂和淋洗液 的洗脱强度过强 降低样品溶剂淋 洗液的洗脱强度 样品溶液体积或浓 度过高，发生“穿透” 降低样品量或 增加填料质量 没有很好的对SPE 柱进行预处理 加入溶剂进行 活化和平衡 回收率低 B 目标物未被完全洗脱：当目标物在样品流出液或淋洗液中未出现而且洗脱液中仅有少量出现。 可能原因 改进办法 小柱对化合物保留太强 找不到合适的洗脱溶剂 选择对目标物 保留稍弱的SPE柱 洗脱液洗脱强度不够 提高洗脱液的洗脱强度 洗脱液体积太小 增大洗脱体积 回收率低 回收率低 C 其它环节：如果目标化合物在在样品流出液或淋洗液中未出现且在洗脱液中正常出现。 可能原因 改进办法 SPE前的提取效率不足 选择合适的提取溶剂 前处理步骤太繁琐 目标化合物损失 适当简化前处理过程 目标物挥发性较强 在浓缩步骤损失大 调整浓缩方式 目标化合物在前处 理溶剂环境中分解 掌握目标化合物的物理化学性质，调整溶剂体系 可能原因 改进办法 上样前，柱床干涸 重新活化并平衡 吸附剂填装不够紧实 提出换货，或用 工具挤压柱床 样品液流速过快 降低流速，通常流速低于 5 mL/min时，结果稳定 重现性差 流速过低 可能原因 改进办法 样品溶液含有较多颗 粒杂质，堵塞了筛板 上样前对样品溶液 进行离心或过滤 样品溶液黏度太高 对样品进行稀释 SPE 柱柱床太高， 对液体的阻力过大 使用辅助工具：固相萃取仪， 液体出口减压；液体入口加压 例1. 人血清中胆汁酸的SPE（后续HPLC测定） 活化：SPE柱（ODS）依次用5ml甲醇和5ml水预处理； 上样：100μL血清样品； 洗涤：样品通过柱子后,用20mL水冲洗； 洗脱：用2mL甲醇将胆汁酸洗脱下来。 浓缩或复溶：在45℃下用N2将洗脱液吹干,1mL丙酮复溶； 衍生化：UV衍生； 分析：取20μL样品做HPLC分析（ODS柱）。 例2：紫衫醇SPE (使用Sep-Pak C18硅胶柱) ①活化: 往柱中依次加入 1 0ｍｌ乙酸乙酯、甲醇和 0.01mol/L pH5.0的乙酸铵水溶液并抽干。 ②样品上柱: 将100mg红豆杉浸膏溶解于40%～60%的甲醇/乙酸铵水溶液后加到柱中,抽干。 ③杂质淋洗: 先用10ml的含20%甲醇的乙酸铵缓冲液淋洗并抽干,然后用10ml含60%甲醇的乙酸铵淋洗。 ④紫杉醇洗脱 :在淋洗好的柱子中加入10ml含80%甲醇的乙酸铵,收集洗脱液,减压蒸干.紫杉醇的质量控制可用ＨＰＬＣ分析。 3.3.6 其他固相萃取技术 固相微萃取（SPME） solid phase microextraction SPME装置类似色谱进样针，针头（石英纤维头）外表面涂有高分子涂层，有机分析物遵循“相似相溶”原理被萃取富集到固相涂层。 Fiber SPME（纤维针式SPME）。 SPME通常与色谱在线联用。是集进样、萃取、浓缩功能于一体的样品前处理技术。 纤维针 Fiber-SPME 样品 搅拌子 * 纤维针式固相微萃取（Fiber-SPME） In-tube-SPME-GC 加热解吸 GC柱温箱 SBSE（固相微萃取搅拌棒技术） 涂层较厚，萃取容量明显增大，富集能力优于纤维头，适合痕量样品和复杂基体。 目标物从样品扩散进入涂层较慢。 吸附搅拌棒代替纤维萃取头。吸附棒通常为内有铁芯的玻璃棒，玻璃棒表面再覆盖萃取涂层。 固相微萃取膜（SPMEM） 将涂层材料均匀地涂在铝铂、玻璃板上，形成膜状萃取涂层。 吸附容量大。通过增大膜面积来增大吸附容量。 不需要专门设备，成本低。 膜通常一次性使用，避免了交叉污染。 由于缺乏大体积GC进样口或热解析池，通常采用溶剂解析，因此膜必须耐有机溶剂。 膜的厚度和大小难以准确控制，用于定量分析较难。 3.2.3 影响分配的参数 温度：影响相图，影响分配系数。 荷电PEG作为成相聚合物： 在聚合物上引入电荷可增大两相间的电位差。 盐类 pH值 盐浓度对分配系数K的影响 盐类的影响： 在两相间形成电位差，对带电生物大分子产生很大影响。 pH值： 改变盐的解离程度（如磷酸盐），进而改变相间电位差。 pH值对分配系数K的影响 pH值： 改变蛋白质所带的电荷的性质和大小，这是与蛋白质的等电点相关的； PEG/盐系统的分配系数的调节 3.2.4 双水相萃取技术的应用 主要用于胞内酶的提取、精制； 用双水相萃取技术处理细胞匀浆液： 可方便除去细胞碎片，使酶得到精制。 蛋白质在多数情况下收率能达90%； 从微生物细胞萃取的酶 （ 续前 ） 亮氨酸脱氢酶 球形牙孢杆菌 PEG/粗Dex 20 9.5 98 2.4 D-乳酸脱氢酶 乳杆菌 PEG/盐 20 4.8 95 1.5 L-2-羟基异癸酸脱氢酶 乳杆菌 PEG/盐 20 10 94 16 D-2-羟基异癸酸脱氢酶 干酪乳杆菌 PEG/盐 20 11 95 4.9 NAD-激酶 纤维二糖乳杆菌 PEG/盐 20 - 100 3.0 亮氨酸脱氢酶 蜡状牙孢杆菌 PEG/盐 20 15 98 1.3 富马酸脱氢酶 产氨短杆菌 PEG/盐 20 3.3 83 7.5 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 明串珠菌 PEG/盐 35 6.2 94 1.3 甲酸脱氢酶 假丝酵母 PEG/盐 33 4.9 90 2.0 甲酸脱氢酶 ? PEG/粗Dex 20 7.0 91 nd 甲醛脱氢酶 ? PEG/粗Dex 20 11 94 nd 异丙醇脱氢酶 ? PEG/盐 20 19 98 2.6 酰基芳香酰氨酶 荧光假单孢菌 PEG/盐 15 30 95 3.0 在医药工业中的应用 从发酵液中将丙酰螺旋酶素与茵体分离后进行提取，可实现全发酶液萃取操作。 采用PEG／Na2HPO4体系，最佳萃取条件是PH=8.0～8.5，PEG2000(14％)／Na2HPO4(18 ％)，小试收率达69.2 ％，对照的乙酸丁酯萃取工艺的收率为53.4％。 丙酮和乙醇双水相萃取、荧光法测定痕量维生素B2 丙酮- 硫酸铵-水和乙醇-硫酸铵-水体系双水相萃取 萃取率分别为97.16 %～98.14 %和94.12 %～95.15 %; 检出限分别为0.031 和0.041μg 该方法已成功用于片剂和注射液中维生素B2 的测定 多步双水相萃取分离纯化的酶 思考题 双水相体系是怎样形成的？萃取原理？ 双水相萃取的影响因素有哪些？ 三、固相萃取技术 (Solid Phase Extraction，简称SPE) 液液萃取(LLE) 固相萃取(SPE) 免疫亲和柱 GPC 高速均质器 溶剂加速提取 微波提取 旋转蒸发仪 氮吹仪 提取 分离 浓缩 检测 GC GC/MS HPLC HPLC/MS 样品分析流程 3.3.1 简 介 操作与柱层析类似 固相萃取：以固体吸附剂作固定相，将目标物或干扰物吸附到固定相中，使目标物与基体或干扰组分分离的一种样品前处理技术。 柱层析 特点（与溶剂萃取比） 操作简单、快速； 减少乳化现象； 可处理大量样品； 不需要使用大量有机溶剂； 应用样品对象十分广泛。 3.3.2 原 理 固相萃取原理：基于待测组分与样品基体在固定相上吸附和分配性质的不同 固相萃取模式：正相、反相、吸附和离子交换 正相固相萃取 采用极性固定相，可从非极性溶剂样品中萃取有机酸、碳水化合物和弱阴离子等极性物质。 极性基团与固定相表面极性基团之间的相互作用（氢键、?-?键、偶极间相互作用等）。 固定相是以硅胶为载体的二醇基、丙氨基小柱。 反相固相萃取 采用非极性或弱极性固定相，适用于萃取从非极性至中等极性的化合物； 基于范德华力和色散力的疏水相互作用； 固定相是在硅胶载体表面键合了疏水性烷烃，如十八烷、辛烷、二甲基丁烷。 离子交换固相萃取 采用离子交换剂固定相，用来萃取有机和无机离子性化合物，如有机碱、氨基酸、核酸碱、离子性表面活性剂等。 被萃取离子因与固定相表面的离子交换基团之间的静电相互作用而保留 固定相是在硅胶载体表面接上季铵基、磺酸基、羧酸基等。 吸附固相萃取 以吸附剂（氧化铝、硅胶、石墨碳材料、大孔吸附树脂等）作固定相； 除石墨碳材料和大孔吸附树脂也可以萃取非极性物质外，吸附固相萃取主要用于极性化合物的萃取。 1 4 保护色谱柱不受污染 ,延长使用寿命 1 1 1 1 净化：去除干扰物，优化色谱图，增加定量准确性 1 2 富集：浓缩样品增加灵敏度 3 转换溶剂：适合色谱分析 固相萃取的作用 离子交换相互作用 Coulomb Power 非极性相互作用 Non-Polar Interaction 极性相互作用 Polar-Interaction 共价键 Covalent 固 相 萃 取 过 程 涉 及 的 作 用 力 色散力 取向力和氢键 相反电荷的 相互吸引 化学键 固相萃取过程涉及的作用力 淋洗 洗脱 洗脱 上样 活化 目标物 干扰物 保留目标化合物 保留干扰物 固相萃取的净化模式 硅胶基质 聚合物基质 专用柱 3.3.3 固相萃取柱 其它吸附剂 Si—OH Cl—Si(CH3)2—R + Si—O—Si(CH3)2—R 硅胶 硅烷化试剂 硅胶键合吸附剂 R：-(CH2)3C6H4SO3- R：-(CH2)3N+(CH3)3 SCX SAX 黄色代表离子交换吸附剂 硅胶键合吸附剂 R：-C2H5 R：-C8H17 R：-C18H37 R：-C6H5 R：-(CH2)3CN R：-(CH2)3NH2 R：-(CH2)3NH(CH2)2NH2 未进行键合处理 C2 C8 C18 PH CN 红色代表反相吸附剂 蓝色代表正相吸附剂 含亲水基团的聚苯乙烯/二乙烯基苯共聚吸附剂(简称PLS) 典型的亲水亲脂平衡吸附剂 极性亲水基团 (能够与化合物上的极性基团发生相互作用) 非极性亲脂基团 (能够与化合物上的非极性基团发生相互作用) PLS共聚物结构示意图 高分子聚合物吸附剂 混合型聚合物吸附剂 PXC PXA PWC PWA PLS 协同萃取机理—取代机理 如果形成的萃合物中含有自由萃取剂HA，则加入中性萃取剂S后，S取代HA生成更稳定或更疏水的萃合物。 UO22+＋3HOx(org) ? UO2(Ox)2HOx(org) ＋2H＋ UO2(Ox)2HOx(org)＋TOPO(org) ? UO2(Ox)2TOPO(org)＋HOx(org) 有时，加入强配位体后，也可以部分取代配位数已饱和的单一配体萃合物。 Pu(TTA)4(org)＋HNO3＋TOPO(org) ? Pu(TTA)3?NO3?TBPO(org)＋ HTTA 协同萃取机理—溶剂化机理 如果金属的配位数没有饱和，只有一部分被萃取剂A配位，剩下的配位部分被水分子占据，当加入中性萃取剂S后，S取代水分子，形成A和S的协同萃取体系。 Y(TTA)3 ?2H2O(org)＋ 2TBP(org) ? Y(TTA)3 ?2TBP(org)＋ 2H2O 同时使用两种以上萃取剂，大大提高萃取效率 Uo22+-TTA-TBPO La+与噻吩甲酰三氟丙酮（HTTA）形成的螯合物为La(HTTA)3(H2O)2,加入1，10—邻二氮杂菲或2，2—联吡啶等杂环萃取剂（以S表示），它表示置换上述螯合物中的水分子形成La(HTTA)3S三元络合物 主要协同萃取体系 体 系 类 型 实 例 阳离子交换与中性配合 P204和TBP萃取UO22+ 不同的二元 阳离子交换与胺类协同 TTA和TOA萃取Th4+ 协萃体系 中性配合与胺类协同 TOPO和TOA萃取Am3+ 阳离子交换与阳离子交换 TTA和HAA萃取RE3+ 相同的二元 中性配合与中性配合 TBP和Ar2SO萃取UO22+ 协萃体系 三元协萃体系 阳离子交换/中性配合/胺类 P204/TBP/R3N萃取UO22+ 3.1.3.4 中性配合萃取体系 特点: 被萃取物在水相中以中性分子形式存在 萃取剂也是中性分子（含有适当配位基团） 被萃取物与萃取剂形成中性配合物 TBP-煤油体系从硝酸溶液中萃取硝酸铀酰 被萃取物形式：UO2(NO3) 2 （铀的其他形态如UO22＋, UO2NO3＋等不被萃取） 萃取剂：TBP（磷酸三丁酯） 中性配合物： UO2(NO3) 2·2TBP 常用的中性配合萃取剂 中性含磷萃取剂： 磷酸酯；膦酸酯；次膦酸酯；膦氧化物；焦磷酸 酯；膦的有机衍生物 中性含氧萃取剂： 酮，酯，醇，醚等，如MIBK（甲基异丁基酮） 中性含硫萃取剂： 亚砜，硫醚 中性含氮萃取剂：吡啶等。 萃取强酸：非极性溶剂可以萃取近乎中性分子的弱酸，但不能萃取强酸；极性溶剂（醇，醚，酮，酯）可以萃取强酸。 如 醚萃取硝酸： H+ + NO3－ + E ? HNO3·E 或者 H+ ＋ NO3－ ＋ H2O ＋ E ? HNO3·H2O·E 有机相中溶剂化的H+与溶剂或水分子形成氢键。 中性配合萃取举例 萃取金属离子 UO22＋ + 2NO3－ + 2TBP ? UO2(NO3)2·2TBP 萃合物的结构： 3.1.3.5 有机物的萃取 相似相溶原则： 极性组分易溶于极性溶剂 非极性组分易溶于非极性溶剂 3.1.5 影响萃取的各种因素 (1). 萃取剂浓度的影响 自由（游离）萃取剂浓度增加，分配系数上升。 自由萃取剂浓度指有机相中未参与形成萃合物的萃取剂浓度。 浓度高到一定程度后会出现活度系数降低的趋势。 TBP浓度与UO2(NO3)2分配系数 的关系 影响萃取的各种因素 (2). 酸度的影响 在中性配合萃取体系中，酸度直接影响与金属形成中性盐的阴离子的浓度。 阳离子交换萃取体系中H＋直接和金属离子竞争萃取剂。 (3). 金属离子浓度的影响 金属离子浓度较低的情况下，对萃取几乎无影响，但当金属离子浓度很高时，会导致有机相中游离萃取剂浓度降低，从而降低分配系数。 影响萃取的各种因素 (4). 盐析剂的影响 盐析现象：使得金属分配系数上升的现象。 盐析剂往往含有与被萃物相同的阴离子，加入盐析剂将产生同离子效应，使分配系数上升。 由于盐析剂的水合作用，使得水相中的一部分水成了它们的水合水，从而降低了自由水的浓度。 影响萃取的各种因素 (5). 温度的影响 主要看萃取反应是吸热还是放热反应。 温度对TBP萃取铀的影响 有机相：0.35 mol/L TBP 水相：0.1 mol/L UO2(NO3)3，1mol/L HNO3 影响萃取的各种因素 (6) 样品溶液中杂质离子的影响 水相中存在的能与金属离子配合的阴离子会抑制（减弱）萃取配合物的生成 杂质阴离子对铀在TBP中分配系数的影响 影响萃取的各种因素 (7)萃取剂的影响 萃取剂的结构和性质直接影响其与金属离子的配位。 (8)稀释剂的影响 稀释剂：加入有机相中起溶解萃取剂、减小有机相粘度、抑制乳化等作用的惰性溶剂。 稀释剂影响萃取剂的聚合。 稀释剂可能与萃取剂形成氢键。 （9）第三相（乳化层）形成的影响 产生乳化的原因： 萃取过程中剧烈振动，特别是含脂肪的样品； 温度越低、有机相粘度越大、离子浓度越高，越易产生乳化。 乳化：液体分散在另一不相溶的液体中的分散体系； 乳浊液：液体杂质以微小珠滴散布在液体溶剂中的一种分散体系，是热力学不稳定体系。 影响萃取的各种因素 破乳方法 高度乳化对策： 离心破乳。2000r/min，2min； 无水硫酸钠研磨法破乳； 蒸干法。蒸干后再用有机溶剂萃取。 一般破乳方法： 加破乳剂改变溶剂性能或化学平衡； 用缓冲剂调节pH； 用电解质调节离子强度。 中、轻度乳化对策 中度乳化对策： 电解质破乳。加入无机盐，提高体系中水相比重使两相分层。破乳率与加入电解质的量成正比。 加入1mol／L的盐酸。 无水乙醇溶解两相液滴。 无水硫酸钠漏斗过滤。 轻度乳化对策： 玻璃棒搅动，削弱吸附作用。 静置一定的时间后，可自然分层。 思考题 为什么用连续萃取数次的方法，要达到单次萃取同样的萃取率，只需用较少量的有机溶剂？ 说明分配系数、分配比和分离因数三者的物理意义。 3. 什么是协萃体系？为什么协同效应会显著的提高萃取 效率？举例说明之。 4. 某有机酸在与水中的分配比是2.50，将5.00g溶于100mL水中形成水溶液。 （1） 用萃取3次，每次用量为20mL （2）用60mL萃取1次。 试分别计算残留在水相中酸的克数。 二.双水相萃取技术 Aqueous two—phase extraction ATPE 普通溶剂萃取不易用于蛋白质的分离： 许多蛋白质有极强的亲水性，不溶于有机溶剂； 蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。 双水相萃取现象 1896年 Bei Jerinck 明胶＋琼脂 明胶＋可溶性淀粉 两相 上相：含大部分明胶 下相：含大部分琼脂（或可溶性淀粉） 1956年瑞典lund大学的Albertsson教授对双水相系统进行比较系统研究，为双水相萃取系统的发展奠定了理论基础。 1978年Kula教授将双水相萃取技术用于酶的大规模分离纯化，建成了一套工业装置。 双水相萃取可分离各种生物大分子、重金属离子以及小分子，如抗生素、氨基酸和植物的有效成分等的分离纯化。 发展概况 双水相萃取的基本特点 两相的性质差别较小； 两相的界面张力很小： 条件温和，体系具有生物亲和性 所需溶液少，操作方便 分离迅速，步骤简便 操作易控制 可进行萃取性的生物转化 基本概念和分类 双水相系统：某些有机物之间或有机物与无机盐之间，在水中以适当浓度溶解后形成的互不相溶的两相或多项系统； 分类： 聚合物-聚合物-水系统：聚合物分子的空间阻碍作用 聚合物-无机盐-水系统：盐析作用 3.2.1 双水相的形成 两种聚合物溶液相互混合，分层或混合成一相取决于： 体系熵的增加； 分子间作用力。 大分子间的混合，分子间作用力占主导地位而决定混合结果。 双水相的形成 2.2%葡聚糖水溶液 等体积的0.72%甲基纤维素钠水溶液 混合静置 0.39%葡聚糖 0.65%甲基纤维素钠 98.96%水 1.58%葡聚糖 0.15%甲基纤维素钠 98.27%水 聚合物的不相溶性：两种聚合物分子间有斥力存在（某种分子希望在它周围的分子系同种分子而非异种分子)，达到平衡后，就有可能分成两相，两种聚合物分别进入到一相。 a 双节线 系线 b 双节线 均相区 均相区 两相区 两相区 系线 相 图 两水相形成的 条件和定量关系 研究最多的几种典型双水相系统 双水相系统的分类 按照物质在双水相系统的分配作用类型，可分为空间排阻分配、电化学分配、构型相关性分配、亲和分配、疏水分配和手性分配等类型。 3.2.3 影响分配平衡的参数 成相聚合物的浓度： 接近临界点，蛋白质均匀分配于两相，K接近1； 成相聚合物总浓度增加，系统远离临界点，两相性质差别增大，蛋白质趋向一侧分配，K或大于1，或减小低于1。 聚合物分子量的影响 例：用 CCl4 萃取 I2 ( R=1)， V有 =100 mL， m0 = 0.20 g，D = 85 1)、萃取一次 ，m1 = 0.0023 g E % = 98.8 2)、分两次萃取，每次用50 mL 有机溶剂 E % = 99.9 结论： V有/V水与D对mn的影响相同，可以相互补偿 若V有一定，通过少量多次萃取可以提高E 在萃取中， 当lgKd不满足定量分离要求时，可采用逆流型多级萃取方式，经过若干级萃取后也可满足定量分离的要求。 物料(A+B) 有机相 水相 新鲜有机相 新鲜水相 新鲜有机相 新鲜水相 A B 逆流型多级萃取方式 萃取分离过程的实质： 将待萃取组分由亲水性转化为疏水性， 使其萃入有机相中。 物质 亲水性 疏水性 离子型化合物 极性 共价键化合物 弱极性或非极性 相互转换 hydrophilic hydrophobic 3.1.2 萃取分离的基本原理 极性基团 非极性基团 物质亲水性与疏水性强弱的规律 凡是离子都有亲水性。 物质含亲水性基团越多，其亲水性越强。 常见的亲水基团：-OH，-SO3H，-NH2，=NH等。 物质含疏水性基团越多，相对分子质量越大，其疏 水性越强。常见的疏水基团：烷基、芳香基等。 反萃取 有时需要采取与萃取相反的步骤，把有机相的物质 再转入水相中，这一过程称为反萃取。 例：8-羟基喹啉-CHCl3对Al 3+ 的萃取 萃取剂：8-羟基喹啉溶剂：CHCl3 3 亲水 疏水 溶于CHCl3 亲水性水合阳离子→中性疏水螯合物→萃入有机相 萃取剂----“运载工具” 在pH8-9碱性溶液 丁二酮肟 中和电荷 引入疏水基 反萃取： Ni2+由疏水性的螯合物转化为亲水性，将有机相的物质再转入水相，称为反萃取。向丁二酮肟镍螯合物的氯仿萃取液中加入盐酸（0.5-1.0mol/L），螯合物被破坏，Ni2+又恢复了亲水性，重新回到水相。 3.1.3 几种重要的萃取体系的讨论 3.1.3.1 形成鳌合物（内络盐）的萃取体系 3.1.3.2 形成离子缔合物的萃取体系 3.1.3.3 三元络合萃取体系 3.1.3.4 中性配合萃取体系 3.1.3.1 形成鳌合物的萃取体系 特点： 萃取剂通常是既溶于水又溶于有机溶剂的有机酸 被萃取物通常是金属阳离子，它与有机酸生成配合物或螯合物。 Mn+(aq) + nHR(org) ? MRn(org) + nH+(aq) 有机酸萃取金属离子的过程可以看作是水相中的阳离子与有机酸HA中的H+交换反应。 主要适用于微量和痕量物质的分离，不适用于常量物质的分离，常用于痕量组分的萃取光度法测量。 常用的螯合剂---有机弱酸 双硫腙（打萨宗） 与Ag+、Au3+、Bi3+、Cd2+、Hg2+、Cu2+、Co2+、Mn2+、Ni2+、Pb2+、Zn2+、Tl等金属离子反应形成疏水性螯合物。可用CCl4萃取。 铜铁试剂（铜铁灵,N—亚硝基苯胲铵, NCP） 与Al3+、Fe3+、Cu2+、Co2+、Ti4+、Zn2+、等多种金属离子反应形成疏水性螯合物。可用CHCl3萃取。 8-羟基喹啉及衍生物 与多种二价、三价和少数四价金属离子反应形成疏水性螯合物。 可用CHCl3萃取。 乙酰丙酮(HAA) 与Al3+、Fe3+、Cu2+、Co2+、In3+、Ga2+等金属离子反应形成内络盐。可用CHCl3 、CCl4、C6H6萃取。 二乙基胺二硫代甲酸钠（ 铜试剂 DDTC) 与Ag+、Bi3+、Cd2+、Hg2+、Cu2+、Co2+、Mn2+、Ni2+、Fe3+等金属离子反应形成螯合物。 可用CCl4或乙酸乙酯萃取 丁二酮肟 可萃取Ni2+、Pd2+可用CCl4萃取。 常用的螯合剂---有机弱酸 1 萃取剂在水相和有机相中的分配平衡 2 萃取剂在水相中的离解平衡 … … … …（1） … … … …（2） 萃取速率 3 被萃取离子和萃取剂的螯合平衡 4 生成的螯合物在水相和有机相中的分配平衡 … … … …（3） … … … …（4） 整个萃取过程的分配比 MLn在水相中溶解度很小，与[Mn+]相比[MLn]可以忽略： 把(1).(2). (3).(4)式代入 整理得： 讨论：(1) 分配比与被萃取组分的浓度无关。 (2) 对于同一种被萃取组分、同一种溶剂 和萃取剂KD、?n Ka KD均为常数。 (3) 若有机相中萃取剂的浓度一定 萃取条件依据： 萃取条件的选择 萃取剂与萃取的离子形成螯合物稳定性好； 螯合物易溶于有机溶剂； 萃取剂本身酸性强； 萃取剂较易电离和较易溶于水。 选择萃取剂 形成螯合物愈稳定， ?n愈大 愈易溶于有机溶剂， KD愈大 萃取剂酸性愈强， Ka愈大 萃取剂愈易溶于水， KD’愈小 D增大有 利于萃取 选择萃取溶剂 一般应使螯合物有较大的溶解度； 螯合剂有较小的溶解度； 溶剂的比重与水相差较大； 粘度较小； 毒性、挥发性较小。 酸度的选择 溶液的pH增大，D增大，? 萃取完全。 萃取率与[H+]关系： 设V有=V水 以pH—横坐标 E—纵坐标 萃取曲线 例：用氯仿为溶剂，用0.1mol/L 8-羟基喹啉为萃取剂， 萃取Ga3+、In3+、Al3+ 萃取曲线）溶液的pH增大，E%增大，? 萃取完全。 （2）三条曲线形状与斜率完全一样。 （3）三种不同的螯合物开始被萃取时的pH及 萃取完全时的pH不同。 问题：金属离子分离完全的酸度条件？ 一般E%=50%的pH值来表征萃取曲线-E) = lgK*’ + npH （2）E%=50% lgK*’= -npH1/2 （3）lgE - lg(100-E) = npH - npH1/2 通常可以用萃取曲线的大小判断能否分离完全。如何判断？ 组分A、B，当A被萃取≥99%时，B被萃取≦1%，即可认为A、B分离完全。 A、B分离完全的条件 nA= 2, nB=2时：ΔpH1/2 ?2 nA= 2, nB=3时：ΔpH1/2 ?1.67 nA= 1, nB=1时：ΔpH1/2 ?4 nA= 1, nB=2时：ΔpH1/2 ?3 nA= 3, nB=3时：ΔpH1/2 ?1.3 A、B分离完全 例 双硫腙为萃取剂，氯仿为萃取溶剂。 各种双硫腙螯合物的萃取曲线+溶液中用二苯硫腙—CCl4萃取 萃取Hg2+，若控制溶液的pH等于1．则Bi3+，Pb2+，Cd2+不被萃取 要萃取Pb2+，可先将溶液的pH调至4—5，将Hg2+，Bi3+先除去，再将pH调至9—10，萃取出Pb2+ 例：用萃取FeCl3——佯盐萃取 3.1.3.2形成离子缔合物的萃取体系 需要注意的问题： 溶液酸度：酸度足够 溶剂：RORROHRCOOHRCOOR RCORRCOH 络阴离子的亲水性和稳定性： 亲水性弱，稳定性好 需要注意的问题： 盐析作用 1阴离子↑，同离子效应 2减少了水分子与被萃取金属离子的结 合能力 3减弱水的偶极矩作用 需要注意的问题： 盐析作用 3.1.3.3 三元络合萃取体系 (１) 形成三元络合物 (2) 协同萃取体系 协同萃取作用: 混合萃取剂同时萃取某一物质时，其分配比显著大于相同浓度下各单一萃取剂分配比之和。即： 有协同效应： D协同?D加和＝D1＋D2＋… 无协同效应： D协同?D加和 反协同效应： D协同?D加和 协萃系数R： R=D协同/D加和 协同萃取机理 生成了更稳定的含有两种以上配位体的可萃物； 生成的配合物疏水性更强，更易进入有机相中。 如单独阳离子交换萃取反应： Mn+ ＋ n HA (org) ? MAn(org) 加入中性配合萃取剂S后的协同萃取反应： Mn+ ＋n HA(org) ＋x S(org) ? MAnSx (org) ＋n H＋ 若D＝1，则萃取一次的萃取百分率为50％； 若要求萃取百分率大于90％，则D必须大于9。 当分配比D不高时，一次萃取不能满足分离或测定的要求，此时可采用多次连续萃取的方法来提高萃取率。 在含有被分离物质的水溶液中，加入萃取剂和与水不相混溶的有机溶剂，震荡，利用物质在两相中的分配不同的性质，使一些组分进入有机相中，使另一些组分仍留在水相中，从而达到分离的目的。 基本原理：相似相溶（Like dissolves like） （1）萃取：利用物质在两种不互溶（或微溶） 溶剂中溶解度或分配比的不同来达 到分离、提取或纯化目的的一种操作。 （2）以从水溶液中萃取有机物为例 1.为什么溶质会转移？ 2.如何达到分配平衡？ 任务：选择适当的萃取剂，在适当的条件下，促 使物质由亲水性向疏水性转化。 水合离子的正电性被中和，亲水的水分子被疏水有机大分子取代 水合离子的正电性被中和，亲水的水分子被疏水有机大分子取代 水合离子的正电性被中和，亲水的水分子被疏水有机大分子取代 第三章 萃取分离法 分类 液-液萃取分离法 双水相萃取法 固相微萃取法 胶团萃取 超临界萃取法 溶剂微胶囊萃取 亚临界水萃取 浊点萃取 一.液 液 萃 取 液液萃取法简称萃取分离法，它是利用与水不相混溶的有机溶剂同试液一起振荡，一些组分进入有机相，另一些组分仍留在水相中，从而达到分离的目的。可用于大量元素的分离，也适用于微量元素的分离和富集。 萃取过程的本质是将物质由亲水性转化为疏水性的过程。 液-液 萃 取 3.1.1 萃取分离的基本参数 3.1.2 萃取过程和萃取体系的分类 3.1.3 几种重要的萃取体系的讨论 3.1.4 有机物的萃取 3.1.5 萃取操作 溶剂萃取法的发展过程 19世纪中叶人们就知道用有机溶剂萃取某些无机物； 如1842年Peligot用二萃取硝酸铀酰； 1872年Berthelot和Jungfleisch根据经验提出了液-液分配的 定量关系； 1891年Nernst从热力学观点阐明了液-液分配的定量关系； 20世纪40年代以后，溶剂萃取走向成熟(完善的理论体 系，丰富的萃取模式，广泛的应用领域)。 溶剂萃取的优缺点 优点： 仪器设备简单、操作方便。 分离选择性高。 应用范围广（无机和有机物；常量和微量组分）。 处理量大，适于工业分离，易于连续自动操作。 缺点： 有机溶剂易挥发，多对人体有害。 手工操作比较麻烦，费时。 分离效率不高（比LC小2?3个数量级）。 溶剂萃取（溶剂萃取，简称萃取） 利用组分在两个互不相溶的液相中的溶解度差而将其从 一个液相转移到另一个液相的分离过程称。 被萃取物（萃合物） 指原先溶于水相，然后被有机相萃取的物质。 萃取液和萃余液 萃取分层后的有机相称为萃取液，此时的水相为萃余液。 基本概念 萃取剂 指能与被萃取物质发生化学反应，形成能溶于有机相的 萃合物的试剂。或指能与亲水性物质反应生成可被萃取 的疏水性物质的试剂。 萃取溶剂 指与水不相混溶且能够构成连续有机相的液体。 活性萃取溶剂 可与被萃取物发生化学反应，形成配合物、离子缔合物 或溶剂化物。例：磷酸三丁酯，正丁醇等。 惰性萃取溶剂 本身不与被萃取物发生化学反应，仅起溶解被萃取物， 改变萃取剂的物理性质，使萃取两相易于分层的作用。 例：四氯化碳，三氯甲烷，苯等。 助萃剂（助萃络合剂） 水相中加入能促进被萃取物的分配比或萃取率增大的络 合剂，是萃取过程中不可缺少的辅助试剂。 例：二安替比林甲烷(DAPM)萃取钴，生成能溶于 CHCl3的(DAPM)·H2[Co(SCN)4]。 萃取剂： DAPM；萃取溶剂： CHCl3； 助萃剂: SCN- 反萃取剂 一种新的不含被萃取物的水相与萃取液接触，使被萃取物 返回水相的过程叫反萃取；使被萃取物返回水相的物质叫 反萃取剂。 盐析剂 指易溶于水而不被萃取，但能促进萃取物转入有机相，提 高萃取效率的无机物盐类。 3.1.1萃取分离的基本参数 (1)分配定律 当溶质A在两种互不相溶的溶剂（如：水和有机相）中分配，有：A水 A有机 在分配过程达到平衡后，溶液A在两种溶剂中浓度的比值为分配系数KD (2)分配比D 分配比D是对溶质存在形式的校正 D的数值由实验得到 简单体系：D＝KD 同一溶质，同样两相，测量方法不同D也不同 (3)萃取百分数E E与D的关系 当R = 1时， 在分析工作中，一般常用等体积的溶 剂来萃取。V水=V有 D=1000时， E%=99.9% 萃取完全 D=100时， E%=99.5% 当组分含量较少可认为 萃取完全 D=10时， E%=90% 一次萃取不完全 D E % 100 1.0 0.01 100 50 0 D 1 9 99 999 E % 50 90 99 99.9 分配比越大，萃取率越高 有机相的体积越大，萃取率越大（R越小） 萃取率与被萃物的含量大小无关，这就是所谓的“定量分离” (4)分离系数β ?=1，即DA=DB， 两种组分不能或难以萃取分离。 ??1，即DA ? DB，两种组分可用萃取分离，且?值越 大，分离效果越好。 ??1，即DA ? DB，表明两种组分可用萃取分离，且? 值越小，分离效果越好。 实现A与B的一次萃取完全分离，应选择或控制萃取条件，使得DA≥102，DB≤10-2。 分三种情况 物化中，对于热力学体系，一定T、P下，A在两相中达到平衡时： 用PA表示热力学分配常数： 以上校正了溶液浓度 质点间作用力 例１．Ｉ2在水相和有机相中存在形式对D 的影响 例２．pH影响：用萃取苯甲酸 讨论 D与水中[H+]浓度有关： 若[H3+O]↑，则pH↓、D↑， 溶质大部分留于水相中； 若[H3+O]↓，则pH↑、D↓， 溶质大部分进入有机相中； 对于弱酸、弱碱萃取，注意pH 例３．连续萃取 若D＝1，则萃取一次的萃取百分率为50％； 若要求萃取百分率大于90％，则D必须大于9。 当分配比D不高时，一次萃取不能满足分离或测定的要求，此时可采用多次连续萃取的方法来提高萃取率。 在含有被分离物质的水溶液中，加入萃取剂和与水不相混溶的有机溶剂，震荡，利用物质在两相中的分配不同的性质，使一些组分进入有机相中，使另一些组分仍留在水相中，从而达到分离的目的。 基本原理：相似相溶（Like dissolves like） （1）萃取：利用物质在两种不互溶（或微溶） 溶剂中溶解度或分配比的不同来达 到分离、提取或纯化目的的一种操作。 （2）以从水溶液中萃取有机物为例 1.为什么溶质会转移？ 2.如何达到分配平衡？ 任务：选择适当的萃取剂，在适当的条件下，促 使物质由亲水性向疏水性转化。 水合离子的正电性被中和，亲水的水分子被疏水有机大分子取代 水合离子的正电性被中和，亲水的水分子被疏水有机大分子取代 水合离子的正电性被中和，亲水的水分子被疏水有机大分子取代

　　原创力文档创建于2008年，本站为文档C2C交易模式，即用户上传的文档直接分享给其他用户（可下载、阅读），本站只是中间服务平台，本站所有文档下载所得的收益归上传人所有。原创力文档是网络服务平台方，若您的权利被侵害，请发链接和相关诉求至 电线) ，上传者